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1. Erzeugung von Tumorsphäroiden einheitlicher Größe
HINWEIS: Stammähnliche Zellen werden in neurobasalem Medium kultiviert, das mit B27-Supplement, Heparin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2), Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Diese Zellen bilden in Kultur spontan Sphäroide.
- Waschen Sie die Tumorzellen mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5-1 mL Dissoziationsenzym für 5 Minuten bei 37 °C.
- Waschen Sie mit 4-4,5 mL PBS und fügen Sie 10 mL des vollständigen Wachstumsmediums (vollständiges neurobasales Medium, cNBM) hinzu.
- Zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik mit Trypanblau und einem Objektträger der Zellzählkammer.
- Um 100 Sphäroide mit 104 Zellen pro Sphäroid (entsprechend der bevorzugten Größe) zu erzeugen, mischen Sie 106 Zellen in 8 mL NBM mit 2 ml 2% Methylcellulose.
- Übertragen Sie die Suspension in einen sterilen Systembehälter und geben Sie 100 μl/Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette in eine runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen.
- Die Platte wird bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Es bilden sich gleich große Sphäroide, die nach 3-4 Tagen verwendet werden können.
2. Dreidimensionale Experimente
- Invasion
- Vorbereitung
- Präparation der Kollagenmatrix in einem Röhrchen auf Eis mit Typ-I-Kollagen in einer Endkonzentration von 1 mg/ml, 1x PBS, 0,023xVKollagen, 1 M Natriumhydroxid und steriles H2O. Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang auf Eis.
- Sammeln Sie Sphäroide aus der runden Vertiefungsplatte in 500 μL-Röhrchen und waschen Sie sie 2x mit 200 μl 1x PBS.
- Pipettieren Sie die Sphäroide vorsichtig in 100 μl der Kollagenmatrix und setzen Sie sie in der Mitte einer Vertiefung in normale 96-Well-Platten ein.
- Inkubieren Sie das Kollagengel 30 Minuten lang bei 37 °C und geben Sie dann cNBM auf das Gel. Inhibitoren oder Aktivatoren (z. B. Chlorwasserstoff, wie in Abbildung 1B, 1C) können dem Medium in diesem Schritt zugesetzt werden.
- Bildaufnahme und -analyse
- Nehmen Sie nacheinander Bilder mit einem Videomikroskop im Hellfeldmodus 24 h nach dem Kollageneinschluss auf.
- Verwenden Sie Fiji, um Bilder entweder manuell oder halbautomatisiert zu analysieren. Zeichnen Sie dazu manuell mit dem Freihandauswahlwerkzeug um den Kern und die Gesamtfläche des Sphäroids herum und messen Sie die invasive Fläche jedes Sphäroids, indem Sie die Gesamtfläche mit der Kernfläche subtrahieren. Um die Bilder halbautomatisiert zu analysieren, verwenden Sie ein Makro, um den invasiven Bereich zu bestimmen.
