Generierung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Guyon, J., et al. Ein 3D-Sphäroidmodell für Glioblastome. J. Vis. exp. (2020)

Das Video zeigt die Erstellung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion. Sphäroide werden aus menschlichen Hirntumorzellen gebildet und in eine Kollagenmatrix eingebettet. Die Tumorzellen an der Peripherie der Sphäroiden nehmen einen invasiven Phänotyp an, sezernieren Proteasen, um das Kollagen abzubauen, und dringen vor, um in die umgebende Matrix einzudringen.

Protokoll

1. Erzeugung von Tumorsphäroiden einheitlicher Größe

HINWEIS: Stammähnliche Zellen werden in neurobasalem Medium kultiviert, das mit B27-Supplement, Heparin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2), Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Diese Zellen bilden in Kultur spontan Sphäroide.

Waschen Sie die Tumorzellen mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5-1 mL Dissoziationsenzym für 5 Minuten bei 37 °C.
Waschen Sie mit 4-4,5 mL PBS und fügen Sie 10 mL des vollständigen Wachstumsmediums (vollständiges neurobasales Medium, cNBM) hinzu.
Zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik mit Trypanblau und einem Objektträger der Zellzählkammer.
Um 100 Sphäroide mit 10⁴ Zellen pro Sphäroid (entsprechend der bevorzugten Größe) zu erzeugen, mischen Sie 10⁶ Zellen in 8 mL NBM mit 2 ml 2% Methylcellulose.
Übertragen Sie die Suspension in einen sterilen Systembehälter und geben Sie 100 μl/Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette in eine runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen.
Die Platte wird bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Es bilden sich gleich große Sphäroide, die nach 3-4 Tagen verwendet werden können.

2. Dreidimensionale Experimente

Invasion
1. Vorbereitung
  1. Präparation der Kollagenmatrix in einem Röhrchen auf Eis mit Typ-I-Kollagen in einer Endkonzentration von 1 mg/ml, 1x PBS, 0,023xV_Kollagen, 1 M Natriumhydroxid und steriles H₂O. Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang auf Eis.
  2. Sammeln Sie Sphäroide aus der runden Vertiefungsplatte in 500 μL-Röhrchen und waschen Sie sie 2x mit 200 μl 1x PBS.
  3. Pipettieren Sie die Sphäroide vorsichtig in 100 μl der Kollagenmatrix und setzen Sie sie in der Mitte einer Vertiefung in normale 96-Well-Platten ein.
  4. Inkubieren Sie das Kollagengel 30 Minuten lang bei 37 °C und geben Sie dann cNBM auf das Gel. Inhibitoren oder Aktivatoren (z. B. Chlorwasserstoff, wie in Abbildung 1B, 1C) können dem Medium in diesem Schritt zugesetzt werden.
2. Bildaufnahme und -analyse
  1. Nehmen Sie nacheinander Bilder mit einem Videomikroskop im Hellfeldmodus 24 h nach dem Kollageneinschluss auf.
  2. Verwenden Sie Fiji, um Bilder entweder manuell oder halbautomatisiert zu analysieren. Zeichnen Sie dazu manuell mit dem Freihandauswahlwerkzeug um den Kern und die Gesamtfläche des Sphäroids herum und messen Sie die invasive Fläche jedes Sphäroids, indem Sie die Gesamtfläche mit der Kernfläche subtrahieren. Um die Bilder halbautomatisiert zu analysieren, verwenden Sie ein Makro, um den invasiven Bereich zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Glioblastom-P3-Sphäroid in Proliferations-, Invasions- oder Migrationsassays. (A) Proliferations-Assay. Linkes Bild: Repräsentative Bilder mit DMSO als Kontrolle oder mit 20 μM Rotenon (Inhibitor des respiratorischen Kettenkomplex-I) zum Zeitpunkt 0 oder 72 h. Rechtes Bild: Quantifizierung des Sphäroidbereichs, dargestellt als gestrichelte Lin...