Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung von Tieren überprüft und genehmigt.
1. α-Synuclein (αS) Extraktion aus präparierten Hirnregionen
- Präparieren Sie ein ganzes Gehirn in einer 35-mm-Plastik-Petrischale auf Eis mit einer Lupe mit geringer Leistung (8-fache Vergrößerung) mit zwei Forcipen, deren Enden zusammengehalten werden, außer beim Präzieren des Hippocampus. Überschreiten Sie nicht 10 Minuten, um die Integrität des Gehirns zu erhalten. Platzieren Sie das Gehirn mit der rechten Seite nach oben und holen Sie die folgenden Gehirnregionen in dieser Reihenfolge:
- Trennen Sie einen der beiden Riechkolben mit einer Pinzette, die direkt dahinter platziert ist. Löse es vom Gehirn, indem du es nach unten bewegst. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Glühbirne.
- Klemmen Sie die Pinzette vorsichtig zwischen die beiden Kortikale und bewegen Sie sie nach vorne, um die Dissoziation der beiden Kortikale zu erleichtern. Halten Sie das Gehirn mit einer Pinzette an Ort und Stelle und verwenden Sie eine andere, um den Kortex vom Hippocampus zu trennen.
- Positionieren Sie die Pinzette 2 mm unterhalb der Rinde. Üben Sie einen sanften Druck auf die Pinzette aus, bis die Spitze des Hippocampus sichtbar ist. Ziehe den ersten Teil der Rinde ab und wiederhole den Vorgang mit dem zweiten Teil. Trennen Sie mit der Pinzette die beiden Kortexe, beginnend am Hippocampus und hin zur Vorderseite des Gehirns.
- Positionieren Sie die offene Pinzette um einen der Hippocampus. Schließen Sie die Pinzette am unteren Ende des Hippocampus und entfernen Sie sie vorsichtig, um so viel wie möglich zu erholen. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Hippocampus.
- Positionieren Sie die offene Pinzette unter einer der Striata und trennen Sie sie vorsichtig vom Gehirn. Verwenden Sie die Pinzette, um den verbleibenden Kortex aus dem Striatum zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das zweite Striatum.
- Verwenden Sie die Pinzette, um die Kontur des Kleinhirns sanft um 2 mm zu drücken, um die Trennung vom Gehirn zu erleichtern. Platzieren Sie die Pinzette direkt hinter dem Kleinhirn und entfernen Sie sie, indem Sie die Pinzette nach vorne bewegen.
- Verwenden Sie den breiten Teil der Pinzette, um das Mesencephalon anzuheben, um deutlich zu sehen, wo es mit dem Hirnstamm zusammentrifft. Mache einen vertikalen Schnitt an der Verbindungsstelle und entferne dann den Hirnstamm.
- Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Mesencephalon, das aus vier abgerundeten Strukturen besteht. Senkrecht einschneiden, bis das Mesencephalon vollständig vom restlichen Gehirn getrennt ist.
- Bereite Homogenate mit variablem Prozentsatz (Gewicht/Volumen) in Puffer mit hohem Salzgehalt (HS) vor, abhängig von der Anzahl der verfügbaren Gewebe: 5% Homogenat für ein Gewicht zwischen 10 und 30 mg, 10% für ein Gewicht zwischen 30 und 80 mg und 20% für ein Gewicht über 80 mg.
- Fügen Sie den präparierten Gehirnregionen ein ausreichendes Volumen an HS-Puffer hinzu, um den erwarteten Prozentsatz an Homogenat zu erhalten.
- Vortex und überprüfe, ob das Gewebe vollständig in den HS-Puffer eingetaucht ist.
- Homogenisieren Sie Proben, die aus den präparierten Hirnregionen oder dem zervikalen Rückenmark hergestellt wurden, mit einer Gewebeschleifmaschine, die aus einem Borosilikatglasrohr und zwei Stößeln A und B besteht.
- Gießen Sie jede Gehirnregion, die zerkleinert werden soll, direkt in die Röhre. Stößel A in das Rohr einführen und einziehen. Wiederholen Sie diese Bewegung etwa zehnmal, um das Gewebe zu dissoziieren. Verwende dann Stößel B, um das Gewebe mit weiteren 20 Bewegungen weiter zu schleifen. Übertragen Sie die Homogenate mit einer 1 ml Transferpipette in ein 1,5 ml Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C, um alle ungemahlenen Gehirnfragmente zu entfernen. Entnehmen Sie die Überstände, teilen Sie sie in 200 μl Aliquote auf und bewahren Sie sie für die spätere Analyse bei -80 °C auf.
1. Nachweis von αS mittels ELISA
- Verdünnen Sie die Beschichtungsantikörper auf 0,01 ng/ml. Verwenden Sie entweder anti-αS Kaninchen polyklonalen oder monoklonalen Klon 42 Antikörper in 50 mM Na2CO3/NaHCO3 Puffer (pH 9,6).
- Beschichten Sie die 96-Well-Mikrotiterplatten mit 100 μl pro Vertiefung dieser Beschichtungslösung und belassen Sie sie bei 4 °C O/N. Verwenden Sie den polyklonalen Anti-αS-Kaninchen-Antikörper in der Beschichtungslösung für ELISAs unter Verwendung der Nachweisantikörper syn514, Klon 42, LB509, AS11, 4D6 oder 8A5. Der monoklonale Anti-αS-Antikörper Klon 42 ist als Beschichtungslösung in Kombination mit dem anti-pSer129 αS-Nachweisantikörper zu verwenden.
HINWEIS: Falls erforderlich, können die Platten eine Woche lang bei 4 °C gehalten werden, bevor der ELISA durchgeführt wird. - Verwenden Sie einen Plattenwascher, um die Platten fünfmal mit 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 (PBST) pro Vertiefung zu waschen. Ab diesem Schritt erfolgt die Inkubation auf RT.
- Fügen Sie 200 μl T20 PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) Blockierungspuffer pro Vertiefung hinzu. 1 Stunde bei 150 U/min schütteln. Waschen Sie die Teller fünfmal mit PBST.
- Verdünnen Sie die Gehirnhomogenate (Verdünnung 1:100 der 20%-Homogenate, 1:50 der 10%-Homogenate und 1:25 der 5%-Homogenate in PBST BSA 1%) und fügen Sie 100 μl zu jeder Vertiefung hinzu. Dann 2 Stunden lang unter Schütteln bei 150 U/min inkubieren. Waschen Sie die Teller fünfmal mit PBST.
- Fügen Sie die verschiedenen αS-Nachweisantikörper in PBST mit Rinderserumalbumin (BSA) 1% bei den in der Materialliste genannten Verdünnungen hinzu. 1 Stunde bei 150 U/min inkubieren. Waschen Sie die Teller fünfmal mit PBST.
- Fügen Sie entweder Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate hinzu, verdünnt 1:8.000 in PBST, ergänzt mit BSA 1% für 1 Stunde, während Sie bei 150 U/min schütteln. Waschen Sie die Teller fünfmal mit PBST.
- Geben Sie 100 μl 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang im Dunkeln unter Schütteln bei 150 U/min.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μl 1 N HCl pro Vertiefung hinzufügen und dann die Extinktion bei 450 nm mit dem Mikroplatten-Reader messen.
- Für die Datenanalyse subtrahieren Sie den OD-Wert, der in einer Vertiefung mit allen Reagenzien mit Ausnahme von Maushirnproben (leere Vertiefung) erhalten wurde, von den OD-Werten, die für jede der analysierten Proben gemessen wurden.