Modellierung der Metastasierung von Hirntumoren durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Zusammenfassung

Quelle: Lim, M., et al. Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader. J. Vis. Exp. (2022)

In diesem Video wird eine anästhesierte Maus einem chirurgischen Eingriff unterzogen, bei dem Krebszellen in die Arteria carotis communis (CCA) injiziert werden, um eine gezielte Abgabe an das Gehirn zu ermöglichen. Das Verfahren beinhaltet ein präzises Nähen und Manipulieren der Halsschlagadern, um die injizierten Zellen in Richtung der Arteria carotis interna (ICA) zu leiten und so die Tumorbildung im Gehirn im Laufe der Zeit zu fördern.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.

1. Vorbereitung von Krebszellen für die Injektion

HINWEIS: In dieser Studie wurde die humane Brustkrebszelllinie BT-474 (BT474) verwendet. BT474 wurde in einem vollständigen Wachstumsmedium kultiviert, das aus RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 Medium bestand, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Insulin ergänzt wurde. Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid in der Luftatmosphäre gehalten. Authentifizierung der Zelllinie durch Satelliten-Tandem-Wiederholungstests, Bestätigung der Expression des Reporterproteins (z. B. Luciferase), falls vorhanden, und Überprüfung auf Mykoplasmeninfektion.

1. BT474-Krebszellen mit einer Aussaatdichte von 2,0 × 10^6 Zellen in einen T75-Kolben unter Verwendung von 10 ml vollständigem Wachstumsmedium und Kultur (bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid) bis zu 70 %-80 % Konfluenz vor der Injektion säen.
2. Am Tag der Injektion verwerfen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellmonoschicht zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Geben Sie 5 ml vorgewärmtes Zellkultur-Dissoziationsreagenz hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C oder bis sich die Zellen abgelöst haben. Klopfen Sie nach 5 Minuten vorsichtig auf den Kolben, um die Zellablösung zu unterstützen.
4. Fügen Sie 5 ml vollständiges Wachstumsmedium mit 10 % fötalem Rinderserum hinzu, um die Aktivität des Dissoziationsreagenzes zu löschen.
5. Resuspendieren Sie die Zellen sanft durch Pipettieren, um Zellverklumpungen zu reduzieren.
6. Die Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen geben und bei 180 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
7. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Kalzium und Magnesium, um die Zellverklumpung zu minimieren.
8. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur bei 180 x g für 3 min.
9. Dekantieren Sie den Überstand, um das restliche Serum/Dissoziationsreagenz zu entfernen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 mL HBSS.
10. Legen Sie ein 100-μm-Zellsieb auf ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen und leiten Sie die Zellsuspension hindurch, um Zellklumpen zu entfernen.
    HINWEIS: Eine einzellige Suspension ist unerlässlich, um den Verschluss von Blutgefäßen und das Risiko eines Schlaganfalls bei der Injektion zu minimieren.
11. Berechnen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses und eines Hämozytometers unter Verwendung von Standardmethoden.
12. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit HBSS auf eine Zellkonzentration von 2,5 x 10⁶ Zellen/ml.
13. Halten Sie die Röhre waagerecht auf Eis und schaukeln Sie die Röhre regelmäßig vorsichtig, um ein Verklumpen zu minimieren. Die Zellsuspension kann maximal 6 h auf Eis gelagert werden.
    {{}}HINWEIS: Das Schaukeln wurde manuell durchgeführt, kann aber auch mit einem Shaker bei niedrigen Drehzahlen erfolgen.

2. Vorbereitung der Maus für den Eingriff

HINWEIS: In dieser Studie wurden 4-5 Wochen alte, weibliche NOD-Scid-Mäuse verwendet. Führen Sie den Mäusen 3 Tage vor dem Eingriff weiche Erholungsnahrung (z. B. Diätgel, Hydrogel, püriertes Mäusefutter) ein, um die Fütterung nach dem Eingriff zu fördern.

1. Autoklavieren Sie chirurgische Instrumente. Sprühen und wischen Sie den Operationsbereich und die Geräte mit Flächendesinfektionsmittel ab, gefolgt von 70% Ethanol.
2. Legen Sie eine Tierheizmatte unter die Operationsplatte, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Schalten Sie diese 30 Minuten vor der Operation ein. Sprühen und wischen Sie die Operationsplatte mit Flächendesinfektionsmittel ab, gefolgt von 70% Ethanol.
3. Bereiten Sie einen sauberen Stallkäfig und ein warmes Heizkissen für die Genesung vor.
4. Ziehen Sie saubere persönliche Schutzausrüstung an (Kittel, Maske, Haarnetz und Handschuhe). Bewahren Sie die Sterilität während des gesamten Eingriffs mit sauberen Untersuchungshandschuhen und einer Technik, bei der nur Instrumente verwendet werden.
5. Betäuben Sie die Maus mit einer Anästhesiekammer mit 5% Isofluran mit einem Sauerstofffluss von 2 L/min, bis die Maus den Pedalreflex verliert.
6. Nehmen Sie das Tier aus der Kammer und setzen Sie es in einen Nasenkonus, der 2 % Isofluran bei einem Sauerstofffluss von 2 l/min für den verbleibenden chirurgischen Eingriff liefert.
7. Ohrstanzmaus zur Identifizierung und verwenden Sie eine elektrische Haarschneidemaschine, um das Fell aus der Halsregion zu rasieren. Reinigen Sie überschüssiges Haar mit Klebeband von der freiliegenden Haut.
8. Wiegen Sie die Maus, um die erforderlichen Dosen von Anästhetika und Analgetika zu berechnen. Verabreichen Sie Buprenorphin und Meloxicam in einer Dosis von 50 μg/kg bzw. 1 mg/kg durch subkutane Injektion.
9. Übertragen Sie die Maus auf eine warme Operationsplatte und befestigen Sie den Nasenkonus mit Klebeband.
10. Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
11. Sichern Sie die Maus vorsichtig, indem Sie zuerst die oberen Schneidezähne mit einem Faden einhaken, der an die Operationsplatte geklebt ist, und dann die Vorder- und Hinterbeine mit Klebeband abkleben. Dieser Schritt streckt den Körper und hält den Hals während des Eingriffs gerade.
12. Führen Sie die präoperative Hautvorbereitung wie unten beschrieben durch.
    1. Wischen Sie den Hals mit einem topischen Antiseptikum (Povidon-Jod) ab, um die Belastung der Hautmikroflora zu reduzieren und lose Haare zu entfernen. Reinigen Sie von der Hautmitte aus und arbeiten Sie sich nach außen, um eine erneute Kontamination der Inzisionsstelle zu verhindern. Wiederholen Sie den Vorgang mit 70% Ethanol. Führen Sie drei abwechselnde Runden mit Jod und Ethanol zur Desinfektion durch.
    2. Legen Sie ein OP-Tuch über das Tier. Dieser wird aus einem Stück sterilem Papiertuch oder Autoklavenbeutel geschnitten und gefertigt.
13. Legen Sie sterile Papiertücher oder Autoklavenbeutel für chirurgische Instrumente aus.
14. Überprüfen Sie, ob Reflex via 'Pinch-Test' ist, um eine ausreichende Anästhesie zu gewährleisten, bevor Sie den Eingriff fortsetzen.

3. Interne Karotisinjektion

HINWEIS: In diesem Experiment wurden eine 31-G-Infusionskanüle und ein fußaktivierter Spritzentreiber verwendet, um das Injektionsverfahren zu erleichtern. Diese Einrichtung ist optional, und der Benutzer kann eine 31-G-Insulinspritze verwenden und die Schritte 3.11 und 3.12 überspringen. Um die Infusionskanüle vorzubereiten, ziehen Sie den Nadelteil und trennen Sie ihn mit zwei Paar Nahtklemmen vom Spritzenanschlußteil einer 31-G-Nadel. Befestigen Sie dann den Nadelteil an einem Ende eines feinen Infusionsschlauchs von einer Länge von etwa 10 cm.

1. Positionieren Sie das Präpariermikroskop über der Maus.
2. Machen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt von 15 mm entlang der Mittellinie im Halsbereich, beginnend 5 mm unterhalb des Kiefers bis zum thorakalen Einlass.
3. Teilen Sie mit zwei Paar abgewinkelter Pinzetten die Haut und die darunter liegenden Speicheldrüsen und legen Sie Retraktoren an, um die Luftröhre freizulegen. Im nächsten Schritt wird die Halsschlagaderscheide freigelegt, die parallel zur Luftröhre verläuft.
4. Präparieren Sie mit zwei Paar feinwinkliger Pinzetten das Muskel- und Fettgewebe neben der Luftröhre, um die rechte Halsschlagaderscheide freizulegen. Die Halsschlagaderscheide ist die fibröse Schicht, die die Arteria carotis, die Vene und den Nervus vagus bedeckt, und dieses Bündel kann durch die hellrote Arteria carotis communis sichtbar gemacht werden. In dieser Studie wurde die Injektion an die rechte Halsschlagader durchgeführt.
5. Befreien Sie ein Segment der Arteria carotis communis kaudal zur Halsschlagadergabelung der umgebenden Faszie und trennen Sie es vom Nervus vagus und den Venen.
6. Isolieren und befreien Sie die Halsschlagadergabelung (die Verbindung, die die äußeren und inneren Halsschlagadern verbindet) von den umgebenden Nerven und Faszien. Positionieren Sie eine feine Pinzette unter der Arteria carotis externa und führen Sie eine Seidennaht (5-0 Dicke) unter die Arterie. Verknoten und festziehen Sie die Naht und schneiden Sie die überschüssige Linie ab.
   HINWEIS: Diese Ligatur (L1) verhindert, dass das Injektor durch die Arteria carotis externa gelangt.
7. Positionieren Sie eine feine Pinzette unter der Halsschlagader und führen Sie eine Seidennaht (5-0 Dicke) unter die Arterie. Binden Sie einen Knoten und ziehen Sie die Naht an einer Position proximal zur vorgeschlagenen Injektionsstelle fest. Schneiden Sie die überschüssige Naht ab und lassen Sie etwa 10 mm Linie übrig.
   HINWEIS: Diese zweite Ligatur (L2) schränkt den Blutfluss und die Blutungen nach der Injektion ein. Es wird auch verwendet, um die Halsschlagader während der Injektion zu positionieren und zu halten.
8. Schneiden und befeuchten Sie einen Streifen (autoklavierter) fusselarmer Einwegwischer ca. 10 mm x 5 mm. Falten Sie den Streifen in eine Größe von 4 mm x 5 mm, 2-3 mm dick, und platzieren Sie ihn unter der Halsschlagader an der vorgeschlagenen Injektionsstelle. Dadurch wird das Gefäß während der Injektion gestützt.
9. Auf der Arteria carotis communis rostral zur vorgeschlagenen Injektionsstelle wird eine dritte Ligatur (L3) mit einem losen Knoten platziert. Diese wird erst nach der Injektion (bei Schritt 3.16) festgezogen.
10. Rühren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf und ziehen Sie 200 μl Zellsuspension in eine Insulinspritze (mit einer 31 G Nadel).
11. Laden Sie die Spritze in den Spritzentreiber, der mit einem aktivierenden Fußpedal verbunden ist.
12. Befestigen Sie eine feine Kanüle mit einer 31 G Nadel an der Spritze und grundieren Sie den Fade.
13. Prüfen Sie, ob die Halsschlagader gut positioniert und unter Druck steht.
14. Führen Sie mit zwei fein abgewinkelten Pinzetten, von denen eine sanft auf das Ende der ersten Ligatur aufgespannt wird und die andere die 31-G-Nadel hält, die Nadel langsam mit der Fase nach oben in das Lumen des Blutgefäßes ein, wobei Sie darauf achten, dass es nicht durchstochen wird.
15. Injizieren Sie langsam 100 μl Zellsuspension (aus Schritt 1.13) mit 10 μl/s in die Arteria carotis communis. Dadurch werden 2,5 × 10^5 Zellen in das Blutgefäß abgegeben. Die erfolgreiche Injektion wird über die Reinigung des Blutes aus dem Karotisblutgefäß visualisiert.
16. Heben Sie die lose Ligatur (L3) (aus Schritt 3.9) unmittelbar nach dem Zurückziehen der Nadel vorsichtig an und ziehen Sie sie fest, um Rückfluss und Blutungen zu vermeiden. Überschüssiges Naht abschneiden.
    HINWEIS: Es ist normal, nach dem Herausziehen der Nadel eine kleine Menge Blutspritzer zu beobachten. Nach dem Anziehen der dritten Ligatur darf es jedoch zu keiner aktiven Blutung kommen.
17. Entfernen Sie das Stück angefeuchtete, fusselarme Einwegwischer.
18. Spülen Sie die Operationshöhle mit einer P200-Pipette zweimal mit 150-200 μl sterilem Wasser oder Kochsalzlösung.
19. Prüfen Sie erneut, ob Blutungen vorliegen, und entfernen Sie dann die Retraktoren.
20. Positionieren Sie das Weichgewebe, die Speicheldrüsen und die Haut über der Halsschlagader und der Luftröhre.
21. Verschließen Sie die Hautschicht des Schnitts mit einem Nahtnadelhalter, einer Pinzette und einem resorbierbaren oder nicht resorbierbaren 6/0-Monofilament-Nahtmaterial in einem kontinuierlichen Muster.
22. Entsorgen Sie die Kanülennadelspritze und bereiten Sie ein neues Setup für die nächste Maus vor. Die Verwendung einer neuen Spritze stellt sicher, dass die Anzahl der Zellen, die in jede Maus injiziert werden, konstant ist.
    HINWEIS: Repräsentative Schnappschüsse des Eingriffs sind in Wenn das Gefäß von der Nadel durchstochen oder zerrissen wird, was durch das Austreten von Injektion oder Blutung angezeigt wird, gilt das Verfahren als erfolglos. Anschließend muss die Nadel zurückgezogen und die dritte Ligatur sofort festgezogen werden, um weitere Blutungen zu verhindern. Wenn die Blutung nach dem Anziehen der Naht anhaltend ist, muss das Tier mit Pentobarbital euthanasiert werden.

4. Genesung nach der Injektion

1. Injizieren Sie Buprenorphin (50 μg/kg) und Meloxicam (1 mg/kg) via{TAG_480}} subkutane Injektion als postoperative Schmerzlinderung.
2. Bringen Sie das Tier in einen warmen und sauberen Käfig, um sich von der Narkose zu erholen. Es ist normal, dass ein Tier nach dem Aufwachen eine gedämpfte Aktivität hat (zusammengekauert und inaktiv oder sich langsam bewegt).
3. Nach 30-45 Minuten werden die Mäuse in eine Langzeithaltungseinrichtung überführt.
4. Geben Sie Mäusen mindestens eine Woche nach der Operation eine weiche Kost (Diätgel, Hydrogel, Brei) und überprüfen Sie täglich den körperlichen Zustand mit besonderem Augenmerk auf Anzeichen von Schlaganfall, Infektion und Blutungen um die Wundstelle.
5. Zwei Tage nach der Operation ist es typisch, dass das Tier eine verminderte Aktivität, ein leichtes zerzaustes Fell und einen Verlust von 15 % des präoperativen Körpergewichts aufweist. Verabreichen Sie 2-3 Tage nach der Operation täglich ein Analgetikum (Meloxicam), um Schmerzen zu lindern und die Genesung zu unterstützen.
6. Ab Tag 3 müssen die Tiere wieder aktiv sein, die Häufigkeit der Fütterung und Fellpflege erhöht und wieder an Gewicht zugenommen haben. Tiere mit anhaltenden körperlichen Defiziten (Schmerzen, zusammengekauert, inaktiv, Gewichtsverlust) werden 4 Tage nach der Operation eingeschläfert, indem Sie Natrium-Pentobarbital in einer Dosis von 200 mg/kg TAG_516 TAG_515 TAG_514 per intraperitonealer Injektion injizieren.
7. Die Tumortransplantation und -progression kann mit Hilfe einer Anästhesie und einer Bildgebungsmodalität der Wahl überwacht werden, wie z. B. Biolumineszenzbildgebung, MRT oder PET/MRT. Die Anforderung und die Fähigkeit, eine solche Bildgebung durchzuführen, hängen von Natur aus von den individuellen Projektzielen und der Einrichtung ab, in der sie durchgeführt wird, sowie von der Art des Reporter-Tags, den verwendeten Zelllinien, der Zugänglichkeit der einschlägigen radiochemischen und nuklearen Bildgebungseinrichtungen.
   HINWEIS: Einige Tiere reagieren möglicherweise nicht gut und erleiden trotz eines erfolgreichen Eingriffs einen Schlaganfall. Nach dem Eingriff müssen Tiere, die Symptome einer neurologischen Belastung aufweisen (Drehen des Kopfes und Ziehen zur Seite, Kreisverhalten, Rollen, Schlagen, Verlust der motorischen Funktion), sofort eingeschläfert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Injektionsprotokolls für die Arteria carotis interna bei Hirnmetastasen. Die Injektion der Arteria carotis interna mit Ligatur der Arteria carotis externa kann zuverlässig ein Hirnmetastasenmodell aus verschiedenen primären Krebsarten erstellen. In diesem Protokoll werden drei Ligaturen auf die Halsschl...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
30G Microlance	needle BD	23748
31G Ultra-Fine II Insulinspritze	BD	326103
Abgewinkelte Pinzette	Proscitech	T67A-SS	Fein zugespitzt, abgewinkelt ohne Zacken, 18mm Spitze, Länge 128 mm
Animal heat mat
Antibiotikum und Antimykotikum	ThermoFisher Scientific<
BT-474 (HTB-20) Brustkrebs-Zelllinie	ATCC	HTB-20
Buprenorphin (TEMGESIC)
Countess cell	counter ThermoFisher Scientific	C10227
Dissektionsmikroskop
Ohr Puncher
Elektrische Schermaschinen
Fein abgewinkelte Pinzette	Proscitech	DEF11063-07	Abgewinkelt 45°, Spitze glatt, Spitzenbreite: 0.4 mm, Spitzenabmessung: 0.4 x 0.3 mm, Länge 9cm
Feiner Schlauch für Kanüle, Schlauch AD (Zoll) 1/32, Schlauch ID (Zoll) 1/100Zoll	Cole Parmer	EW-06419-00
Fötales Rinderserum	ThermoFisher Scientific<
Hank's Balanced Salt Solution ohne Calcium und Magnesium	ThermoFisher Scientific<
Isofluran
Kimwipes Einweg-Wischtücher mit geringen Fusseln	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nasenkegel			Hergestellt aus einer Mikrofuge-Tube
PAA Augenschmiermittel (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidon-Jod-Lösung	Betadine	2505692
PPE (Handschuh, Maske, Kittel, Haarnetz)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Seidennaht 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normale Kochsalzlösung	ThermoFisher Scientific	TM4469
Klebeband
OP-Brett			Ein Schneidebrett, das mit einer autoklavierbaren Tasche umwickelt ist.
Chirurgische Schere	Proscitech	T104	Spitzenabmessungen (LxT): 38x7mm, Länge 115mm
Nahtzange/ Gebogene Brophy-Pinzette	Proscitech	T113C	Gebogene, abgerundete schmale 2 mm Spitze, mit Zacken, Länge 165 mm
Nahtnadelhalter (Olsen Hegar Nadelhalter)	Proscitech	TC1322-180	Länge 190 mm, Ratschenklemme
Spritzentreiber mit Fußpedal/ UMP3 Ultra Mikropumpe	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 Gewebekulturflasche	ThermoFisher Scientific<
Thread
Trigene II Desinfektionsmittel für Oberflächen	Ceva

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