Dieses Video zeigt die Analyse von Peptidproben aus Neuromelanin-Granula (NMGs), die aus menschlichem postmortalem Hirngewebe isoliert wurden. Die Peptide werden zunächst mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt und anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um ihr Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) zu bestimmen. Die Zielpeptide werden fragmentiert, um posttranslationale Modifikationen zu identifizieren, und die resultierenden Daten werden mit einer Referenzdatenbank verglichen, um das proteomische Profil der NMGs zu bestimmen.
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Methodenartikel
LC-MS/MS Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten, die aus menschlichem Hirngewebe isoliert wurden
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Tryptischer Aufschluss
1. Tauen Sie die Proben auf Eis auf.
2. Trocknen Sie die Proben vollständig in einem Vakuumkonzentrator.
3. Füllen Sie die Probe mit 50 μl eines geeigneten Aufschlusspuffers, z. B. 50 mM Ammoniumbicarbonat.
4. Nach der Zugabe von 1,25 μl 200 mM 1,4-Dithiothreitol werden die Proben 30 min lang bei 60 °C und 300 U/min mit einem Thermomischer inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt.
5. Inkubieren Sie die Proben dann 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln nach Zugabe von 1,36 μl 0,55 M Iodacetamid.
6. Geben Sie eine geeignete Menge Trypsin zu den Proben und inkubieren Sie die Proben über Nacht (~16 h) bei 37 °C.
HINWEIS: Für 1.000.000 μm2 wurden 0,1 μg Trypsin als ausreichend befunden.
7. Geben Sie 2,6 μl 10 % Trifluoressigsäure (TFA) zu den Proben, um den Aufschluss zu stoppen (Endkonzentration von 0,5 % TFA).
8. Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator vollständig. Anschließend werden die Proben bis zu einem definierten Endvolumen mit 0,1 % TFA gefüllt. Die NMG-Proben wurden mit bis zu 20 μl gefüllt, von denen 5 μl für ein massenspektrometrisches (MS) Experiment verwendet wurden.
9. Lagern Sie die Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C. Bestimmen Sie die Peptidkonzentration durch Aminosäureanalyse oder eine andere geeignete Quantifizierungsmethode (z. B. Direct Detect).
HINWEIS: Niedrige Probenmengen sind mit den genannten Techniken möglicherweise nicht quantifizierbar. Um eine identische Probenbelastung zu gewährleisten, sollte jede Probe die gleiche Menge an isoliertem Gewebe enthalten, und jede Probe sollte gleich behandelt werden.
2. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie
HINWEIS: Die folgenden massenspektrometrischen (MS) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analysen sind für das spezifische LC-System mit einem hier verwendeten Trapping-Säulengerät und Massenspektrometer optimiert (siehe Materialtabelle). Für andere LC- und MS-Systeme wird eine Anpassung der Parameter empfohlen.
- Passen Sie mit der Software Xcalibur die HPLC-Einstellungen wie folgt an.
- Trap-Spalte: Temperatur auf 60 °C einstellen, Durchflussrate auf 30 μL/min, Puffer auf 0,1 % Trifluoressigsäure laufen lassen.
- Analytische C18-Umkehrphasensäule: Stellen Sie die Temperatur auf 60 °C ein, die Durchflussrate auf 30 μL/min, lassen Sie Puffer A auf 0,1 % Trifluoressigsäure laufen, lassen Sie Puffer B auf 84 % Acetonitril laufen und gradient auf 5 %-30 % laufender Puffer B über 98 min.
HINWEIS: Eine Anpassung des Farbverlaufs kann unvermeidlich sein und wird dringend empfohlen, wenn verschiedene Gewebe oder Zellen verwendet werden. Die Gesamtgradientenzeit kann aufgrund der Probenbelastung zu Beginn des Gradienten und der Probenwäsche am Ende des Gradienten variieren. Der Gesamtgradient in diesem Protokoll besteht aus 7 Minuten Probenladung und zusätzlicher Säulenwäsche für 15 Minuten, was zu einer Gesamtgradientenzeit von 120 Minuten führt.
- Erstellen Sie eine datenabhängige Erfassungsmethode (DDA) mit dem XCalibur Instrument Setup, das im HPLC-Software-Roadmap-Menü zu finden ist.
- Definieren Sie auf der Registerkarte Globale Parameter den Infusionsmodus Flüssigchromatographie, die erwartete LC-Peakbreite (30 s) und den Standard-Ladezustand (2).
- Fahren Sie mit der Registerkarte Scan-Parameter fort und fügen Sie die folgenden Scans und Filter in der angegebenen Reihenfolge hinzu: MS OT, MIPS, Intensity, Charge State, Dynamic exclusion und ddMS2 OT HCD.
Optimale MS- und DDA-Einstellungen können je nach verwendetem Massenspektrometer sowie Probentyp variieren und sollten daher angepasst werden. - Bereiten Sie Proben vor, indem Sie 200-400 ng Probenpeptide in einem definierten Volumen von 0,1% TFA in inerten massenspektrometrischen Glasfläschcheneinlässen auflösen. Wenn die Konzentrationsbestimmung aufgrund einer geringen Probenmenge nicht anwendbar ist, überprüfen Sie die identische Probenbelastung durch Vergleich des Gesamtionenstroms (TIC).
HINWEIS: Öffnen Sie dazu die resultierende Datei der massenspektrometrischen Messung in einer geeigneten Software, z.B. FreeStyle, und überprüfen Sie das Chromatogramm. Die Intensitäten sollten für alle Proben vergleichbar sein. Ein repräsentativer TIC ist in Abbildung 1 dargestellt. - Analysieren Sie die Rohdaten, die mit einer proteomischen geeigneten Software erhalten wurden, z.B. MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics oder Proteome Discoverer, und führen Sie eine statistische Datenanalyse basierend auf der Forschungsfrage durch.
3. Analyse von proteomischen Rohdaten mit MaxQuant
- Laden Sie Rohdateien in die MaxQuant-Software im Rohdaten-Header, indem Sie auf Laden klicken.
- Weisen Sie Probennamen zu, indem Sie auf Set Experiment klicken.
- Definieren Sie gruppenspezifische Parameter. Fügen Sie zunächst Änderungen hinzu. Aufgrund der Probenverarbeitung wählen Sie Deamidierung (NQ), Oxidation (M) und Carbamidomethylierung (N-Term) als variable Modifikationen und fügen Sie Carbamidomethylierung (C) als feste Modifikation hinzu.
- Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym auf der Registerkarte Verdauung.
- Fügen Sie die etikettenfreie Quantifizierungsoption LFQ auf der Registerkarte Etikettenfreie Quantifizierung hinzu. Wenn mehr als 10 Dateien verarbeitet werden sollen, wählen Sie die Option Schnelles LFQ, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen. Fügen Sie die iBAQ-Option als Maß für die Proteinquantifizierung hinzu.
- Stellen Sie sicher, dass alle anderen gruppenspezifischen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben.
- Fahren Sie mit dem Reiter Globale Parameter fort und fügen Sie die von uniprot.org abgeleitete FASTA-Datei im Reiter Sequenzen hinzu. Ändern Sie die Identiatorregel entsprechend und fügen Sie die Taxonomie-ID hinzu, in diesem Fall 9606 für den Homo sapiens.
- Für die Proteinquantifizierung wählen Sie Unique und Razor Peptide.
- Stellen Sie sicher, dass alle anderen globalen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben.
- Klicken Sie auf Start und rufen Sie die proteingroups.txt Ausgabe nach der MaxQuant-Analyse zur weiteren Analyse in Perseus ab.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Gesamtionenstrom (TIC) einer 120 min DDA-Messung. Das Chromatogramm zeigt die relative Häufigkeit der Ionen, die den eluierenden Peptiden entsprechen,...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101< | |
| Acetonitril | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141< | |
| Ameisensäure | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100< | |
| Micro Tube 500< | 415190-9221-000< | ||
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific< | ||
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000< | |
| Trifluoressigsäure | Merck | 91707< | |
| Trypsin sequencing grade< | 37283.01 | ||
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system< | |||
| Name der Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6< | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/< | ||
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:143pt;'>4.3 |
