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1. Erzeugung von Tumor-Sphäroiden in reproduzierbarer Größe
- Sammeln Sie die Diffuse Midline Gliom (DMG) H3K27M-mutierten Neurosphären (NS) und zentrifugieren Sie sie mit 170 x g 10 Minuten (min) bei Raumtemperatur (RT).
- Um die NS aufzubrechen, inkubieren Sie 500 μl der Accutase-Lösung für 3 min bei 37 °C.
- Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung mit Tumorstammzellen (TSM) medium7 und zentrifugieren Sie die Zellenaufhängung bei 355 x g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml TSM-Medium und kontaminieren Sie die Zellen dann mit einer Zellzählkammer.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension, um 2,5-5 x 103 Zellen/ml und Seed 100 μL/Well in 96-Well-Platten mit rundem Boden mit extrem geringer Bindung (ULA) (siehe Table of Materials). Verwenden Sie eine geeignete Zelldichte, um 4 Tage nach der Zellaussaat eine individuelle NS mit einem Durchmesser von ~300 μm zu erhalten (250-500 Zellen/Well für hochaggressive Gliomzellen).
- Bestätigen Sie die NS-Bildung visuell mit einem inversen Mikroskop 4 Tage nach der Zellaussaat.
2. Vorbereitung des Antikörpermarkierungsreagenzes (ALR)/Antikörperkomplexes und Aufbau für den Migrationsassay
- Berücksichtigen Sie die Anzahl der zu analysierenden Wells und berechnen Sie das für jedes Reagenz benötigte Volumen. Anzugeben sind auch die Vertiefungen, die für die Negativkontrollen benötigt werden. Überprüfen Sie den NS visuell mit einem inversen Mikroskop, bevor Sie beginnen.
- Verwenden Sie 96-Well-Platten mit flachem Boden. Führen Sie die Beschichtung durch. Für diese Studie wird die Basalmembranmatrix (BMM) als dünne Beschichtung verwendet.
- Sobald die Beschichtung fertig ist, entfernen Sie die überschüssige BMM-Beschichtung mit einer p200-Spitze, platzieren Sie die Spitze am Rand der Vertiefung und vermeiden Sie es, den Boden zu berühren. Wenn Sie mit mehreren Vertiefungen arbeiten, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.
- Schneiden Sie eine p200-Spitze ab, entnehmen Sie 50 μl des Zellmediums + NS aus jeder ausgewählten Vertiefung und geben Sie sie in eine beschichtete Vertiefung mit flachem Boden. Überprüfen Sie das Vorhandensein und die Position des NS in jeder Vertiefung visuell.
HINWEIS: Jeder NS muss sich zentral im Brunnen befinden. Vermeiden Sie es, sich während des Transfers auf die Spitze am Rand der Vertiefung zu stützen, sondern lassen Sie das Medium mittig in die Vertiefung fallen, ohne den Boden zu berühren. Bei stark wandernden Zellen sollten Sie eine höhere Anzahl von Replikaten als die standardmäßigen drei Replikate in Betracht ziehen. Dies liegt daran, dass, wenn NS zu nahe am Rand der Vertiefung sitzt, die wandernden Zellen einen kleineren Bereich der Vertiefung abdecken können. - Geben Sie 100 μl steriles Wasser in das ALR, um das Reagenz zu rehydrieren (Endkonzentration = 0,5 mg/ml). Piptieren Sie, um die Lösung zu mischen. HINWEIS: Das Reagenz ist lichtempfindlich; Bleiben Sie daher im Dunkeln. Aliquotieren Sie das übrig gebliebene Reagenz und lagern Sie es bei -80 °C (Einfrieren und Auftauen vermeiden).
- Mischen Sie den Antikörper mit ALR in den entsprechenden vollständigen Zellwachstumsmedien in einer Multiwell-Platte mit rundem Boden oder in einem Braunröhrchen und schützen Sie ihn vor Licht. Bereiten Sie eine ausreichende Menge vor, um 50 μl/Well bei 3-facher Endkonzentration des Assays abzugeben. 15 Minuten bei RT inkubieren.
- Verdünnen Sie das Hintergrundsuppressor-Reagenz (BSR) in TSM-Medium (oder einem geeigneten Zellwachstumsmedium für die Zelllinie Ihrer Wahl) bei 1,5 mM (3x), um am Ende des Assays eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erhalten.
NOTE: Reagenz ist lichtempfindlich. Siehe oben für gute Handhabungsverfahren. - Geben Sie vorsichtig 50 μl des BSR in jede Vertiefung.
- Geben Sie vorsichtig 50 μl des ALR/Antikörpers in jede Vertiefung. Warten Sie 2 oder 3 Minuten, um die Reagenzien mischen zu lassen, und überprüfen Sie visuell mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die meisten replizierten NS zentral in der Vertiefung befinden.
- Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und entfernen Sie vorhandene Blasen mit einer Nadel. Übertragen Sie die Platte vorsichtig in das Lebendzellanalyseinstrument, das sich im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2, 95% Luftfeuchtigkeit.
3. Einstellung des Live-Cell-Analyse-Instruments für die Bildaufnahme
- Scannen Sie die Platten mit dem Live-Cell-Analyseinstrument (für Spezifikationen siehe Tabelle von Materials) mit Scan-Intervallen ab dem Zeitpunkt Null (t0) des nach Schritt 2.14 eingerichteten Invasions- bzw. Migrationsassays. und 3.10. bis zu 96 h.
NOTE: Stellen Sie sicher, dass das Lebendzellanalysegerät sofort nach Beginn des Invasions- und Migrationstests entsorgt werden kann. Abhängig von der Tumorart können Zellen bereits innerhalb von 1 h nach dem Assay-Aufbau beginnen, in den NS einzudringen oder aus ihm zu migrieren. - Wählen Sie in der Software für das Lebendzellanalysegerät die Option Zeitplan für die Erfassung. Klicken Sie auf die Registerkarte + Registerkarte und wählen Sie die Option Scan on Schedule.
- Im Softwarefenster Erstellen oder Wiederherstellen von Vessel, klicken Sie auf die Option New.
- Wählen Sie die spezifische Anwendung im Lebendzellanalyseinstrument für den Erwerb von Invasion und Migration aus. Select Spheroid Scan-Typ, 4x Objektiv, Phase+Brightfield style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> undGreen Bildkanäle für den Invasions-Assay. Select Dilution Cloning<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Scantyp, 4x Ziel und Phase und Green für den Migrations-Assay.
- Wählen Sie den Plattentyp aus und definieren Sie die zu scannenden Vertiefungen, indem Sie sie auf der Plattenkarte markieren.
- Richten Sie die Scanfrequenz ein (für die Experimente in diesem Protokoll betrug die Scanfrequenz 15 Minuten für die Invasion und 30 Minuten für die Migration).
- Klicken Sie auf Add to Schedule und starten Sie den Scan.