Charakterisierung von neuroendokrinen Tumorsphäroiden im Dünndarm mittels Immunfluoreszenz

Zusammenfassung

Quelle: Ear, P. H., et. al. Etablierung und Charakterisierung von neuroendokrinen Dünndarmtumor-Sphäroiden. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von neuroendokrinen Dünndarmtumor-Sphäroiden. Die Sphäroide werden fixiert, permeabilisiert und blockiert und anschließend mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Ein Farbstoff wird hinzugefügt, um die Zellkerne zu färben, bevor sie montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Protokoll

1. Sammlung von neuroendokrinen Dünndarmtumoren (SBNET) und Zelldissoziation

1. Entnahme von resezierten SBNET-Proben von Patienten nach Bestätigung des Tumorgewebes aus dem Surgical Pathology Core.
2. Schneiden Sie SBNETs in 5 mm Würfel und lagern Sie sie in 25 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 Medium in einem konischen Röhrchen für den Transport zum Labor.
3. Übertragen Sie die Tumoren auf DMEM, die 1% fötales Rinderserum oder FBS, 1% Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptomycin) und 1% Glutamin (Waschmedium) enthalten, und inkubieren Sie in diesem Waschmedium für 15 Minuten.
4. Übertragen Sie die Tumore in eine neue Schale und zerkleinern Sie sie mit einer sterilen gebogenen Schere in Stücke mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm.
5. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein neues 50 ml Röhrchen mit 25 ml Waschmedium.
6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 15 min bei 4 °C.
7. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 10 mL Waschmedium, das Kollagenase (100 U/ml) und DNase (0,1 mg/ml) enthält.
8. Lassen Sie die zerkleinerten Tumoren in einem 37 °C Inkubator mit langsamem Schütteln (50 U/min) für 1,5 h verdaut werden.

2. Kultur von SBNETs als Tumor-Sphäroide in der Extra Zellulären Matrix (ECM)

1. Nach Abschluss des Aufschlusses (Schritt 1.8) zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 15 mL Waschmedium.
2. Platzieren Sie ein 70 μm Zellsieb auf ein neues 50 mL Röhrchen und übertragen Sie 10 mL des Waschmediums über das Zellsieb. Schwenken Sie das Waschmedium, um die Seite des Kunststoffschlauchs zu bedecken, um zu verhindern, dass NET-Zellen an der Seite des Kunststoffschlauchs kleben.
3. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein Zellsieb.
4. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μL Waschmedium (Gesamtvolumen beträgt ~ 250 μL) und legen Sie es auf Eis.
5. Übertragen Sie 5 μl Zellen auf 500 μl Waschmedium (1/100 Verdünnungsfaktor). Verwenden Sie die verdünnten Zellen für die Zellzählung mit einem Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu erhalten. Multiplizieren Sie mit 100, um den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
6. Multipliziere die Anzahl der Zellen pro ml, die du in Schritt 2.5 erhalten hast, mit dem Gesamtvolumen der Zellen in Suspension, das du in Schritt 2.4 erhalten hast (~ 250 μl).
7. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in flüssigem ECM (1 x 10⁶ Zellen/ml) und bewahren Sie sie auf Eis auf.
8. Übertragen Sie 5-20 μl SBNET-Sphäroide in ECM auf eine 96-Well-Platte und lassen Sie das flüssige ECM erstarren, indem Sie die Platte für 5 Minuten in einen 37 °C Inkubator legen.
9. Gib 200 μl SBNET-Kulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamin + 10 mM Nicotinamid + 10 μg/ml Insulin) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die die SBNET-Sphäroide in ECM enthält.
10. Alternativ können Sie SBNET-Organoide in Stammzellmedien züchten, ähnlich dem, was zuvor für die Züchtung von menschlichen Leber- oder Pankreas-Organoiden beschrieben wurde und in der Materialtabelle aufgeführt ist.
11. Wechseln Sie das Medium alle 5-7 Tage.

3. Charakterisierung von SBNETS-Sphäroiden durch Immunfluoreszenz

1. Übertragen Sie die in ECM gezüchteten Organoide mit einer P1000-Pipette auf ein 1,5-ml-Röhrchen.
2. Zentrifugieren Sie 1 min lang bei 1.500 x g und entfernen Sie den Überstand.
3. Waschen Sie die Organoidkultur, indem Sie 1 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder PBS hinzufügen, mischen, zentrifugieren Sie 1 min lang bei 1.500 x g und entfernen Sie den Überstand.
4. Fixiere die Organoide, indem du 500 μl 4% Paraformaldehyd hinzufügst und 15 Minuten inkubierst.
5. Waschen Sie die Kultur zweimal mit 1 ml PBS.
6. Permeabilisieren Sie die Kultur, indem Sie 500 μl PBS + 3% Rinderserumalbumin oder BSA + 0,1% Triton X 100 für 5 Minuten hinzufügen.
7. Dann dreimal mit 1 mL PBS + 3% BSA waschen.
8. 1 h inkubieren mit Primärantikörpern gegen Synaptophysin (SYP) bei 1/600 Verdünnung oder Chromogranin A (CgA) und Somatostatinrezeptor 2 (SSTR2) bei 1/400 Verdünnung in Antikörperpuffer (2,5% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumazid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid).
   HINWEIS: Verwenden Sie 300 μl oder mehr Antikörperlösung pro Röhrchen.
9. Dreimal mit 1 mL PBS + 3% BSA waschen.
10. Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern, die an FITC gekoppelt sind, bei 1/500 Verdünnung in Antikörperpuffer für 1 h. Verwenden Sie 300 μl oder mehr Antikörperlösung pro Röhrchen.
11. 3 mal mit 1 mL PBS + 3% BSA waschen. Stellen Sie sicher, dass Sie den gesamten Überstand aspirieren und entsorgen.
12. Fügen Sie 5 μl Einbettmedium hinzu, das den nuklearen Farbstoff DAPI enthält.
13. Verwenden Sie eine P20-Pipette, um 5 μL der SBNET-Sphäroide aus Schritt 4.12 auf einen Glasobjektträger zu übertragen und mit einem Deckglas zu verschließen.
14. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den 10x-, 20x- oder 40x-Objektiven auf.

Materialien