Dieses Video zeigt, wie die mitochondriale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in striatalen Hirnschnitten von Mäusen gemessen werden kann. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Gewebeplatte und der Sensorpatrone, zum Laden in den Flussmittelanalysator und erklärt die zellulären Prozesse, die OCR-Mustern zugrunde liegen.
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Methodenartikel
Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten Schnitten des Maushirns
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Hydrat-Kartuschen-Sensoren (1 Tag vor dem Assay)
- Öffnen Sie das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie sowohl die Sensorkartusche (grün) als auch die Versorgungsplatte (durchsichtig; Abbildung 1A). Legen Sie die Sensorkassette beiseite (Sensoren nach oben) und berühren Sie die Sensoren nicht.
- Geben Sie 600 μl kalibrierende Lösung (pH 7,4) in jede Vertiefung der Utility-Platte. Setzen Sie die Sensorkassette auf die Versorgungsplatte und tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrierlösung. Stellen Sie sicher, dass die dreieckige Kerbe der Platte für die Versorgungs- und Sensorkassette richtig ausgerichtet ist (Abbildung 1B).
- Versiegeln Sie das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit mit einer Versiegelungsfolie, um ein Verdampfen der Kalibrantlösung zu verhindern, und legen Sie es dann über Nacht in einen 37 °C-Inkubator, der nicht mit CO2 oder Sauerstoff ergänzt wurde.
2. Bereiten Sie die Gewebeplatte vor (am Tag des Assays)
- Öffnen Sie die Insel-Capture-Mikroplatte und nehmen Sie die Inselplatte heraus, um das Gewebe aufzusetzen.
- Erwärmung eines geeigneten Volumens (625 μl pro Vertiefung) von präoxygenierter, modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, Zusammensetzung 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH 7,2) in einem 50 mL Röhrchen auf 37 °C puffern. Geben Sie dann BSA bis zu einer Endkonzentration von 4 mg/ml hinzu, um den Atmungspuffer vorzubereiten. Im Allgemeinen reichen 50 mL für eine Platte.
- Geben Sie 625 μl Atmungspuffer (präoxygenierter ACSF-Puffer mit 25 mM Glukose und 4 mg/ml BSA) vorsichtig in jede Vertiefung der Inselplatte und vermeiden Sie ein Schütteln der Platte. Stellen Sie sicher, dass sich keine Resttropfen auf der Sensorpatrone befinden und sich keine Luftblasen im Puffer jeder Vertiefung befinden.
3. Akute striatale Schnittvorbereitung und Platzierung der exzidierten Schnitte
- Enthaupten Sie die Maus nach einer zervikalen Luxation und präparieren Sie das Gehirn sofort in 10 mL eiskalter, präoxygenierter Schneidlösung (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM Glukose, pH 7,4).
- Schnitten von koronalen striatalen Schnitten mit einem Vibratom gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) bei einer Dicke von 150 μm in eiskalter, mit Sauerstoff angereicherter Schneidlösung.
- Die Scheiben werden in 50 mL sauerstoffhaltigem ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM Glukose, 2 mM HEPES, pH 7,4) und bis zu 30 min bei Raumtemperatur (RT) in Lösung halten.
- Nach der Genesung werden die Scheiben in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale mit 5 ml Atmungspuffer gegeben.
- Verwenden Sie einen Biopsiestanzer aus Edelstahl (z. B. 1,5 mm Durchmesser), um ein kreisförmiges Stück Gewebe im gewünschten Bereich des geschnittenen Gehirns zu erzeugen. Halten Sie die Scheibe im Puffer, während Sie sie mit der Stanze leicht nach unten drücken. Stellen Sie sicher, dass der Stempel fest genug nach unten gedrückt wird, um das Gewebe zu schneiden. Entferne den Rest des Gewebes, hebe den Stempel weg und entferne das kreisförmige Gewebestück in den Puffer.
- Schneiden Sie das äußerste Ende einer 1-ml-Pipettenspitze ab, um ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2,0 mm zu bohren, und verwenden Sie es, um die gestanzte Scheibe zu halten und an den oberen Rand des Aufnahmebildschirms zu übertragen. Saugen Sie ein Stück gestanztes Hirngewebe ab und legen Sie das Gewebe vorsichtig auf die Netzseite des Erfassungssiebs (Abbildung 2A). Der Aufnahmebildschirm besteht aus einem kreisförmigen Stück Kunststoff, an dem das Netz an einer Seite befestigt ist.
HINWEIS: Die Capture-Bildschirme sind in der Mikroplattenpackung enthalten (siehe Tabelle der Materialien). - Trocknen Sie den Aufnahmebildschirm vorsichtig mit einem Papiertaschentuch kurz ab. Wenn die Feuchtigkeit entfernt wird, wird das Gewebe klebrig, wodurch sich die Scheibe an der Mitte des Netzes festsetzen kann. Trocknen Sie die Scheibe nicht zu stark ab, da sie sonst beschädigt wird.
- Halten Sie das Aufnahmesieb mit einer Pinzette mit der Scheibe nach unten und legen Sie es in eine der Vertiefungen der Inkubationsplatte (Abbildung 2B). Achten Sie darauf, die Scheibe nicht fallen zu lassen; Wenn ja, nehmen Sie den Bildschirm heraus und platzieren Sie ein neues Slice darauf.
HINWEIS: Legen Sie keine Gehirnschnitte in die beiden Hintergrundkorrekturvertiefungen (A1 und D6) in der Inselplatte. - Inkubieren Sie die Inselplatte mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C in einem Inkubator, um einen Temperatur- und pH-Ausgleich zu ermöglichen, bevor Sie den Assay durchführen.
4. Beladen der Kartuschen mit den gewünschten Verbindungen
- Verdünnen Sie die gewünschten Verbindungen in modifiziertem ACSF (37 °C) auf die Endkonzentration von 10x, 11x, 12x bzw. 13x der Arbeitskonzentration für die Anschlüsse A bis D und stellen Sie sie auf pH 7,4 ein. Der Test verabreicht die Verbindungen in der Reihenfolge von Anschluss A nach D. Für dieses Experiment wurden die folgenden Lösungen verwendet, vor denen ihre jeweilige Arbeitskonzentration angegeben wurde: 10 mM Pyruvat (Port A), 20 μM Oligomycin (Port B), 10 μM oder andere Konzentrationen von Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) (Port C) und 20 μM Antimycin A (Port D).
- Laden Sie vorsichtig 75 μl der verdünnten Verbindungen in die entsprechenden Injektionsöffnungen der Sensorkartusche vor. Platzieren Sie die Spitzen auf halber Höhe in einem Winkel von 45° in den Injektionsöffnungen, wobei die Spitze an der Wand der Injektionsöffnung anliegt. Die Spitzen sollten nicht vollständig an der Unterseite der Injektionsöffnungen eingeführt werden, da dies zu einem Austreten von Verbindungen durch den Anschluss führen kann.
- Ziehen Sie die Spitzen vorsichtig aus den Anschlüssen heraus, um Luftblasen zu vermeiden. Klopfen Sie nicht auf einen Teil der Patrone, um Luftblasen zu vermeiden.
- Überprüfen Sie die Einspritzöffnungen visuell, um eine gleichmäßige Belastung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Flüssigkeit in der Öffnung befindet und keine Resttropfen auf der Oberseite der Patrone vorhanden sind.
- Setzen Sie die Sensorkartusche auf die Netzplatte und stellen Sie sie für 30 min in einen Inkubator (nicht CO2), damit sie wieder auf 37 °C aufgeheizt wird. Gehen Sie vorsichtig vor, indem Sie sich nur an der Nutzplatte festhalten. Bewegen Sie sich so wenig wie möglich.
5. Kalibrierung und Durchführung des Assays
- Laden Sie die Assay-Vorlage in die Software. Drücken Sie die grüne START -Taste.
- Stellen Sie sicher, dass Sie das richtige Protokoll geladen haben. Das Protokoll enthält eine Kombination aus 3-Minuten-Mix-, 3-Minuten-Warte- und 2-Minuten-Messsequenzen (diese drei Schritte bilden eine Messung). Ändern Sie den Abstand des Sondenkopfes von 26.600 auf 27.800 in den Hardware-Einstellungen unter Geräteeinstellungen. Es ist nicht erforderlich, den Sondenkopf für den XFe24-Analysator zu wechseln. Drücken Sie START.
- Legen Sie die Sensorkassette auf der Utility-Platte in die Instrumentenablage ein. Die Kerbe befindet sich in der vorderen linken Ecke. Achten Sie darauf, dass die Platte richtig sitzt und flach ist. Legen Sie die mit Medikamenten gefüllte Sensorkartusche zur Kalibrierung in das Analysegerät ein.
- Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensoren zu kalibrieren und auszugleichen. Dies dauert etwa 30 Minuten.
- Sobald der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte und ersetzen Sie sie durch die Inselplatte (mit dem Netz und den Gewebescheiben).
- Messen Sie den Sauerstoffverbrauch in jeder Vertiefung der Platte anhand der Assay-Protokolle. Das Protokoll enthält eine Kombination aus 3-Minuten-Mix-, 3-Minuten-Warte- und 2-Minuten-Messsequenzen (diese drei Schritte bilden eine Messung), an deren Punkt die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) berechnet wird.
- Für das gesamte Experiment sind 4x OCR-Messungen zu erstellen, gefolgt von der Injektion von Port A (Pyruvat) mit 4x Messungen, dann der Injektion von Port B (Oligomycin) mit 8x Messungen, dann der Injektion von Port C (FCCP) mit 5x Messungen und schließlich der Injektion von Port D (Antimycin A) mit 6x Messungen.
HINWEIS: Diese Anzahl von Messungen nach jeder Verbundinjektion wird abhängig davon bestimmt, wann die Messung das Plateau erreicht. - Analysieren Sie die OCR-Messdaten und die Daten zur Kopplungseffizienz.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Bilder, die die Hydratkartuschensensoren und die Platte des extrazellulären Flussanalysators zeigen. (A) Die Sensorkartusche sitzt auf einer Kalibrierplatte (Versorgungsplatte). (B) Seitenansicht der Versorg...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antimycin A von Streptomyces sp. | |||
| Rinderserumalbumin (BSA) | |||
| Carbonylcyanid 4-( Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP) | |||
| D-Glucose | |||
| DMSO | |||
| HEPES | |||
| Befeuchteter Nicht-Kohlendioxid-Inkubator | |||
| Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenes | |||
| Parafilm | |||
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | |||
| Seahorse XF Extrazellulärer Flussanalysator | |||
| Seepferdchen XFe24 Extracellular Flux Analyzer | |||
| Seahorse XF24 FluxPaks | |||
| Sodium pyruvate | |||
| Edelstahl-Biopsiestempel | |||
| Sterile Zellkulturschale, 35 x 10 mm | |||
| Vibratome | |||
| Wasserbad |
