Entwicklung eines experimentellen Aneurysmamodells an einem Kaninchen unter Verwendung eines mit Elastase behandelten Gefäßbeutels

Zusammenfassung

Quelle: Wanderer, S., et al. Arterieller Pouch Mikrochirurgisches Bifurkations-Aneurysma-Modell beim Kaninchen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Erstellung eines experimentellen Aneurysmamodells bei einem Kaninchen unter Verwendung eines mit Elastase behandelten Gefäßbeutels. Nach der Entfernung eines Segments des rechten CCA wird der Beutel mit Elastase behandelt und dann mit dem linken CCA vernäht, um den Blutfluss wiederherzustellen. Die dadurch entstehende Belastung der geschwächten Beutelwände führt zur Aneurysmabildung.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.

HINWEIS: Halten Sie alle Tiere bei einer Raumtemperatur von 22 bis 201224 Grad Celsius (°C) und halten Sie einen 12-stündigen (h) Hell-Dunkel-Zyklus ein. Bieten Sie jedes Mal freien Zugang zu Wasser, Pellets und ad libitum Heufutter. Die statistischen Analysen wurden mit dem nicht-parametrischen Wilcoxon-Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Ein Wahrscheinlichkeitswert (p) von ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen.

1. Präoperative Phase

1. Führen Sie eine detaillierte präoperative klinische Untersuchung aller Kaninchen durch, die unmittelbar neben einem ruhigen, aseptischen Operationssaal bei einer Temperatur von 23 ± 3 °C operiert werden sollen.
   1. Das Gewicht jedes Tieres makroskopisch erfassen und die Schleimhäute bewerten, Kapillarnachfüllzeit und Impulsqualität.
   2. Führen Sie anschließend eine Herzauskultation mit einem Stethoskop und einer Abtastuntersuchung durch.
   3. Ordnen Sie jedem Kaninchen auf der Grundlage der klinischen Befunde eine Klassifizierung der American Society of Anesthesiologists (ASA) zu19. Schließen Sie nur Tiere mit einem ASA-I-Score in die Studie ein.
   4. Rasieren Sie beide Außenohren mit einem Elektrorasierer und tragen Sie Prilocain-Lidocain-Creme auf beide Ohrarterien und Venen auf.
2. Betäuben Sie das Kaninchen mit einer Kombination aus 20 Milligramm (mg)/Kilogramm (kg) Ketamin, 100 mg/kg Dexmedetomidin und 0,3 mg/kg Methadon, die subkutan (SC) über eine Spritze injiziert werden.
3. Lassen Sie jedes Tier mindestens 15 Minuten lang ungestört.
4. Danach wird unter zusätzlicher Sauerstoffzufuhr mit 3 Litern (l) /Minute (min) durch eine lose Gesichtsmaske und ständiger Überwachung durch ein Pulsoximeter eine 22-G-Kanüle in die linke Ohrarterie und eine weitere 22-G-Kanüle in die Ohrvene des kontralateralen Ohrs gelegt.
5. Rasieren Sie das Operationsfeld (Hals) und injizieren Sie 0,75 % periinzisionales Ropivacain. Rasieren Sie sich als Nächstes die Stirn und bereiten Sie sich darauf vor, pädiatrische Elektroenzephalographie-Sensoren (EEG) zu platzieren.
6. Induzieren Sie eine Vollnarkose mit Propofol 1-2 mg/kg intravenös (IV), um zu wirken. Dann intubieren Sie sofort die Luftröhre aller Kaninchen mit einem Silikonschlauch (3 Millimeter (mm) Innendurchmesser) unter kapnographischer Kontrolle. Transportieren Sie anschließend alle Kaninchen in den Operationssaal, legen Sie sie in die Rückenlage und verbinden Sie den Schlauch mit einem pädiatrischen Kreissystem.
7. Erreichen Sie eine Vertiefung und Aufrechterhaltung der Anästhesie durch Isofluran in Sauerstoff, mit dem Ziel einer maximalen endtidalen Isoflurankonzentration von 1,3 %.
8. Stellen Sie die klinische und instrumentelle Überwachung (Pulsoximetrie, Doppler und invasiver Blutdruck, 3-Kanal-Elektrokardiogramm, EEG, rektale Temperaturüberwachung sowie ein- und ausgeatmete Gase) bis zur Trachealextubation sicher.
9. Um die Hydratation aufrechtzuerhalten, wird Ringer-Laktat in einer kontinuierlichen Infusionsrate (CRI) von 5 ml/kg/h über einen venösen Zugang verabreicht. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie immer mit Zehenkneifungen im Abstand von 10 Minuten.
10. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Povidon-Jod aus dem Manubrium sterni bis zu beiden Kieferwinkeln. Führen Sie nun eine sterile Abdeckung des Operationsfeldes durch.
11. Während der Operation ist eine Analgesie mit Lidocain bei einem CRI von 50 Mikrogramm (μg)/kg/min und Fentanyl bei 3 bis 10 μg/kg/h zu verabreichen. Spontane oder assistierte Beatmung sowie permissive Hyperkapnie anwenden. Führen Sie während der Operation mindestens einmal eine arterielle Blutgasanalyse durch.
12. Behandeln Sie die relevante Hypotonie (mittlerer arterieller Druck < 60 mmHg) mit Noradrenalin. Verhindern Sie eine Unterkühlung (Rektaltemperatur ≤ 38 °C) mit einem Heizkissen oder einem Heiz-Umluft-Heizsystem.

2. Chirurgische Phase – Schritt I

1. Beginnen Sie die Operation mit einem medianen Hautschnitt vom Manubrium sterni bis zur Höhe der Kieferwinkel/des Kehlkopfes. Präparieren Sie die Haut und das Weichgewebe scharf mit einem Skalpell, einer chirurgischen Schere und einer Pinzette. Trennen Sie die Unterhaut und das Fettpolster medial durch stumpfe Dissektion.
2. Der vordere obere Kamm des Musculus sternocleidomastoideus wird medial auf der linken Seite durch stumpfe Dissektion mit einer Mikrozange und einer chirurgischen Schere eingesetzt.
3. Führen Sie makroskopisch eine stumpfe Präparation durch und trennen Sie den linken CCA vorsichtig distal vom Vagusnerv, um eine Kehlkopfparese zu vermeiden, indem Sie eine Mikrozange und eine chirurgische Schere verwenden (Abbildung 1). Es ist zu beachten, dass die Bifurkation des linken CCA als intraoperativer Landmarker dient (Abbildung 2 und Abbildung 3A). Verwenden Sie für alle folgenden Schritte einen Weichgewebespreizer, um die chirurgische Visualisierung zu verbessern.
4. Nach erfolgreicher Präparation und Befreiung des linken distalen CCA vom Vagusnerv ist Papaverin (40 mg/ml, 1:1 verdünnt in 0,9%iger isotonischer Natriumchloridlösung) lokal zu verabreichen. Kontinuierlicher Schutz aller Gefäßsegmente mit Mikrotupfern, gefolgt von weiterer Papaverin-Verabreichung nach außen. Legen Sie das Papaverin-getränkte linke CCA unterhalb des autologen Muskelgewebes, um das Gefäß vor dem Austrocknen unter dem Licht des Operationsmikroskops zu schützen.
5. Wechseln Sie die Seite und maximieren Sie gleichzeitig den Komfort des Chirurgen während des operativen Eingriffs. Wiederholen Sie den gleichen chirurgischen Eingriff auf der rechten Seite. Präparieren Sie die CCA distal und proximal bis zu den vordefinierten Landmarken (Carotis-Bifurkation auf Höhe der Kieferwinkel/Kehlkopf und Vena jugularis interna; Abbildung 3A,B). Setzen Sie einen Spreizer wieder ein und verabreichen Sie Mikrotupfer und Papaverin wie zuvor beschrieben.
6. Vor der Ligatur der rechten proximalen CCA ist Heparin (500 Internationale Einheiten (I.E.)/kg) systemisch über einen venösen Ohrkatheter zu injizieren.
7. Verwenden Sie ab sofort ein Operationsmikroskop. Ligatieren Sie zunächst die rechte proximale CCA mit einer 4-0 nicht resorbierbaren Naht direkt am Ende des makroskopisch sichtbaren proximalen Orientierungspunkts, um jegliche Spannung auf das arterielle Gefäß zu vermeiden.
   1. Zweitens wird eine 6-0 nicht resorbierbare Ligatur genau 4 bis 5 mm distal angewendet, indem man einen Gefäßclip zur Messung verwendet, wobei zu berücksichtigen ist, dass nach dem distalen Schneiden von der ersten 4-0 Ligatur der resultierende arterielle Beutel bei jedem Tier eine standardisierte Länge von etwa 3 bis 20124 mm hat (Abbildung 4A,C).
8. Nach dem Anziehen der 6-0-Ligatur wird der rechte CCA mit einem provisorischen Gefäßclip (wie er normalerweise bei der zerebralen Aneurysmachirurgie verwendet wird) so weit wie distal geklemmt, um eine Endothelschädigung zu vermeiden und ein langes Gefäßsegment für die Spülung zu schaffen, um eine Thrombogenese zu verhindern (Abbildung 4B).
9. Führen Sie nun einen Schnitt distal zur nicht resorbierbaren Ligatur 4-0 durch. Um den arteriellen Beutel zu entnehmen (Abbildung 4C), führen Sie einen zweiten Schnitt distal zur nicht resorbierbaren 6-0-Ligatur durch.
10. Reinigen Sie den arteriellen Beutel sorgfältig von sämtlichem Weichgewebe und messen Sie dessen Länge, Breite und Tiefe (Abbildung 4C) mit einem Gefäßclip. Wenn keine weitere Modifikation erforderlich ist, bewahren Sie das autologe arterielle Transplantat bis zur weiteren Verwendung in einer heparinisierten Lösung (500 I.E./100 ml in 0,9% isotonischem Natriumchlorid) bei Raumtemperatur auf.

3. Abbau des arteriellen Beutels

1. Wenn ein Abbau des arteriellen Beutels erforderlich ist, reinigen Sie ihn sorgfältig von Weichgewebe und inkubieren Sie ihn am Tag des Experiments mit 100 IE Schweineelastase, gelöst in 5 ml Tris-Puffer, bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Verwenden Sie keine Pinseltechnik. Inkubieren Sie den arteriellen Beutel intra- und extraluminal mit einem Shaker.
2. Bevor Sie den Beutel in eine heparinisierte Lösung von 0,9 % isotonischem Natriumchlorid legen, wischen Sie ihn 3 Minuten lang vorsichtig dreimal mit einer anatomischen Pinzette in 0,9 % isotonischer Natriumchloridlösung ab, um die restliche Schweineelastase auszuwaschen.
3. Halten Sie das Lumen des arteriellen Beutels bei Bedarf mit einem Mikroröhrchen aus Silikon geöffnet; Schützen Sie den linken und rechten CCA während des gesamten chirurgischen Eingriffs sorgfältig mit nassen Mikropolstern.

4. Chirurgische Phase – Schritt II

1. Zur weiteren Vorbereitung der CCA legen Sie zwei runde Mikrotupfer direkt darunter, um die Arterie oberflächlicher zu bewegen. Legen Sie nun einen Mikrotupfer mit violetter Polsterung unter den linken CCA im distalen Drittel, um die Arterie besser sichtbar zu machen.
2. Spülen Sie die rechte proximale CCA mit einer Lösung aus 0,9 % isotonischem Natriumchlorid in Kombination mit 500 IE Heparin, gelöst in 100 ml 0,9 % isotonischem Natriumchlorid. Um eine spannungsfreie Anastomose zu erzeugen, platzieren Sie die rechte CCA unter dem Fettpolster/der peritrachealen Muskulatur, indem Sie sie mit einer chirurgischen Schere nach links tunneln. Entfernen Sie das Weichgewebe der Arterie.
   1. Führen Sie nun mit einer Mikroschere und einer Pinzette einen 2 mm großen Fischmaulschnitt an der proximalen Seite des rechten CCA durch.
3. Wechseln Sie die Seite auf dem Operationstisch. Clippen Sie die linke distale CCA mit einem weiteren provisorischen Gefäßclip, gefolgt von der proximalen linken CCA mit zwei provisorischen Gefäßclips. Schützen Sie alle freiliegenden Gefäßsegmente mit feuchten Mikrotupfern vor dem Austrocknen unter der OP-Lampe.
4. Befreien Sie das distale Drittel der linken CCA vollständig von Weichgewebe und führen Sie eine Arteriotomie durch. Verwenden Sie eine chirurgische Mikrozange und greifen Sie vorsichtig etwas Weichgewebe. Heben Sie nun die Arterie an und schneiden Sie die linke distale CCA langsam mit einer chirurgischen Mikroschere an. Spülen Sie die Gefäßsegmente mit Heparin (500 I.E. gelöst in 100 ml 0,9%iger isotonischer Natriumchloridlösung).
5. Nach Durchführung der Arteriotomie mit einer gekrümmten Mikrozange und einer Mikroschere wird die Arteriotomie, die sich im distalen Drittel der linken CCA befindet, distal vergrößert und dabei etwa das 2-fache des Durchmessers des rechten stumpfen Stumpfes der Halsschlagader und des autologen Transplantats gemessen. Dadurch kann ausreichend Blut in den arteriellen Beutel fließen.
6. Nehmen Sie den arteriellen Beutel aus der heparinisierten Kochsalzlösung. Legen Sie den Beutel in das Operationsfeld, wo die Bifurkation geplant ist. Beginnen Sie mit dem Nähen der Rückseite der rechten Halsschlagader, die stumpf kaudal gelegen ist, mit einer nicht resorbierbaren 9-0-Naht, gefolgt von einer Naht auf der kranial gelegenen Rückseite auf Höhe des Fischmaulschnitts. Die Rückseite von distal nach proximal mit einzelnen Stichen fertig nähen.
7. Halten Sie während des Nähens alle mit Elastase vorinkubierten Beutel durch kontinuierliche Bewässerung feucht. Verwenden Sie beim Nähen der Gefäßwand des Beutels eine gebogene chirurgische Mikrozange, um das Lumen vorsichtig mit seiner Spitze zu öffnen. Wenn Sie Teile der linken oder proximalen rechten CCA nähen, verwenden Sie eine gerade chirurgische Mikrozange. Anschließend die waagerechte Rückseite vernähen.
8. Als nächstes nähen Sie die horizontale Vorderseite, beginnend an der Kuppel des Aneurysmas und bewegen Sie sich zu seiner Basis. Danach beginnst du mit einzelnen Maschen distal auf der Vorderseite und bewegst dich nach kaudal.
   1. Bei allen Schritten 4.5-8 ist beim Nähen der Anastomose darauf zu achten, nur den Teil des Gefäßes in der Nähe des Arteriottomas zu greifen, um eine iatrogene Stenose zu vermeiden. Befeuchten Sie außerdem während des gesamten chirurgischen Eingriffs kontinuierlich alle Gefäßsegmente extraluminant mit einer Spritze, die mit heparinisierter Natriumchloridlösung (500 IE gelöst in 100 ml 0,9% isotonischem Natriumchlorid) gefüllt ist, und schützen Sie sie mit feuchten Mikrotupfern.
   2. Bevor Sie die Anastomose beenden, spülen Sie den gesamten Komplex mit einer heparinisierten 0,9% igen isotonischen Natriumchloridlösung intraluminal (500 IE gelöst in 100 ml 0,9% isotonischem Natriumchlorid). Achten Sie darauf, dass Elastase-modifizierte arterielle Beutel wegen ihrer starken Neigung zum Austrocknen und zur Thrombose so schnell wie möglich angenäht werden müssen. Aufgrund des aggressiven Verhaltens der Restelastasekonzentration im Pouch in Bezug auf die Verdauung der umlaufenden Gefäße sollte die Operation schnell durchgeführt werden, um den Gefäßkomplex schnell wieder zu perfundieren.
9. Entfernen Sie schrittweise alle provisorischen Gefäßklemmen.
   1. Entfernen Sie die distale Klemme von der linken CCA. Akzeptieren Sie leichte Blutungen und stillen Sie sie, indem Sie vorsichtig Mikrotupfer auf die Anastomose prägen. Entfernen Sie anschließend die Klemme des rechten CCA, drücken Sie vorsichtig mit Mikrotupfer und Pinzette, um Thrombusbildung zu vermeiden.
   2. Ersetzen Sie bei Bedarf die provisorischen Gefäßclips, um eine ausreichende Koagulation zu gewährleisten. Lösen Sie anschließend beide Gefäßklammern proximal von der linken Seite. Ersetzen Sie bei Bedarf die Clips, um eine Koagulation zu ermöglichen oder um neue Nähte durchzuführen.
10. In diesem Stadium führen Sie eine Fluoreszenzangiographie des Gefäßkomplexes durch (Abbildung 5)
    HINWEIS: Die Fluoreszenzangiographie wird durch Verabreichung von 1 ml Fluorescein IV unter Verwendung von 2 Bandpassfiltern, einem Smartphone mit Videokamera und einem Fahrradscheinwerfer durchgeführt. Dieses Verfahren wurde bereits an anderer Stelle beschrieben20,21,22.
11. Schließen Sie abschließend den operativen Standort. Passen Sie das Fettpolster wieder an und vernähen Sie es vorsichtig mit einer resorbierbaren 3-0-Naht mit einzelnen Knoten, um die Anastomose zu schützen. Verschließen Sie die Unterhaut und die Haut auf die gleiche Weise.

5. Postoperative Phase

1. Brechen Sie die Verabreichung von Isofluran und systemischer Analgesie am Ende der Operation ab und führen Sie eine tracheale Extubation durch, sobald der Schluckreflex zurückgekehrt ist.
2. Verabreichen Sie 0,5 mg/kg Meloxicam i.v., 10 mg/kg Aspirin (ASS) i.v., 100 μg Vitamin B12 s.c. und 20 mg/kg Clamoxyl i.v.
3. Sorgen Sie für zusätzliche Sauerstoffversorgung und aktive Erwärmung, bis die Kaninchen spontan wieder auf dem Brustbein liegen.
4. Führen Sie in den ersten drei Tagen viermal täglich eine postoperative Nachsorge und Tierpflege gemäß den Richtlinien für die Beurteilung und Behandlung von Schmerzen bei Nagetieren und Kaninchen durch23,24.
5. Verabreichen Sie die postoperative Analgesie über ein Fentanylpflaster (12 μg/h), das auf das Außenohr aufgetragen wird, Meloxicam einmal täglich SC für drei Tage und Methadon als Notfalltherapie SC, gemäß dem Scoresheet für die Schmerzbewertung. 250 I.E./kg niedermolekulares Heparin (LMH) subkutan über drei Tage bei allen Kaninchen verabreichen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Erster operativer Schritt.

Erster operativer Schritt, der die linke Halsschlagader (weißer Pfeil), den Nervus vagus (schwarzer Pfeil) (A) und die vorsichtige Trennung der linken Halsschlagader vom Nervus vagus distal darstellt, um eine Kehlkopfparese z...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-0 resorbierbares Nahtmaterial	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 nicht resorbierbares Nahtmaterial	B. Braun, Deutschland	G0762563
6-0 nicht resorbierbares Nahtmaterial	B. Braun, Deutschland	C0766070
9-0 nicht resorbierbares Nahtmaterial	B. Braun, Deutschland	G1111140
Adrenaline	Amino AG	1445419	any generic
Amiodaron	Helvepharm AG	5078567	beliebig generisch
Anästhesiegerät	Dräger		any other
Aspirin	Sanofi-Aventis (Suisse) SA	622693	any generic
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	any generic
Bandpassfilter blau	Thorlabs	FD1B	any other
Bandpassfilter grün	Thorlabs	FGV9	any other
Bipolare Pinzette			any other
Fahrradscheinwerfer			any other
Biemer Gefäßclip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Schweiz	FD560R	temporary
Bispectral index (neonatal)			any other
Blutdruckmanschette (Neugeborene)			any other
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	any generic
Dexmedetomidin	Ever Pharma	136740-1	any generic
Elektrokardiogramm-Elektroden			any other
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrin	Amino AG	1435734	jedes generische
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	any generic
Fentanyl (intravenöse Anwendung)	Janssen-Cilag AG	98683	any generic
Fentanyl (transdermal)Mepha	Pharma AG	4008286	jedes generische
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	any generic
Glyco			any generic
Heizkissen			any other
Isotonische Natriumchloridlösung (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Ketamin	Pfizer	342261	any generic
Laborschüttler	Stuart	SRT6	any other
Lidocain	Streuli Pharma AG	747466	jede generische
Longuettes			jede andere
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	jede generische
Methadon	Streuli Pharma AG	1084546	jede generische
Mikroröhrchen			alle anderen
Mikronadelhalter			any other
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	any generic
Nadelhalter			any other
O2-Gesichtsmaske			alle anderen
Operationsmikroskop	Wild Heerbrugg		any other
Papaverine	Bichsel		any generic
Prilocain-Lidocain crème	Emla		any
Propofol	B. Braun Medical AG, Switzerland		any generic
Pulsoxymeter			any generic
Rektale Temperatursonde (Neugeborene)			any other
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	any generic
Scalpell	Swann-Morton	210	any other
Kleintierrasierer			any other
Smartphone			any other
Weichteilzange			any other
Weichgewebespreizer			any other
Edelstahl-Schwammschalen			any other
Sterile Mikrotupfer			beliebig andere
Stethoskop			any other
Gerade und gebogene Mikrozange			any other
Gerade und gebogene Mikroschere			any other
Gerade und gebogene Pinzette			jede andere
OP-Tuch			any other
Chirurgische Schere			any other
Spritzen 1 ml, 2ml und 5 ml			any other
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	any generic
Gefäß-Clip-Applikator	B. Braun, Deutschland	FT495T
Venen- und Arterienkatheter 22 G			any generic
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	any generic
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Schweiz	FT242T	vorläufig

, generic