Impedanzbasierte Messungen der Invasion von Hirntumorzellen

Zusammenfassung

Quelle: Mudduluru, G., et. al. Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Migration und Invasion von Krebszellen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt einen impedanzbasierten Assay zur Messung der Invasion und Migration von Glioblastom-Zellen. Die Zellen bauen die extrazelluläre Matrix ab, bewegen sich durch mikroporöse Membranen und haften an Elektroden, wodurch eine Impedanz erzeugt wird. Diese Echtzeitanalyse spiegelt ihr invasives Potenzial für Anwendungen in der Krebsforschung wider.

Protokoll

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p style='background-color:#ffffff;line-height:1.380000000000001;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>1. Vorbereitung des Echtzeit-Zellanalysesystems, der Zellinvasions- und -migrationsplatten (CIM) und der elektroporierten U-118MG-Zellen für die Beschichtung

1. Platzieren Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem in einem CO₂ Inkubator unter Kulturbedingungen 5–6 Stunden vor Beginn des Experiments, um das System auf die Kulturbedingungen zu stabilisieren.
2. Für den Invasionsassay wird 50 μl DMEM-Gel (glattes Medium) mit extrazellulärer Matrix (ECM) in jeder Vertiefung der oberen Kammer der CIM-Platte in jede Vertiefung der oberen Kammer der CIM-Platte aufgenommen. Um Luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie die umgekehrte Pipettiermethode. Entfernen Sie sofort 30 μl ECM-Gel und lassen Sie 20 μl in der Vertiefung.
3. Nach der ECM-Gelbeschichtung die Platte mit aufgesetztem Deckel 4 h unter Kulturbedingungen im Inkubator aufbewahren. Ergreifen Sie während der ECM-Gelbeschichtung und -trocknung vorbeugende Maßnahmen, um den direkten Kontakt mit den Elektroden der oberen Kammer der Platten mit den Händen, den Oberflächen der Biosicherheitswerkbank oder dem CO₂ Inkubator.
4. Um das Impedanzmessprogramm einzurichten, doppelklicken Sie auf das zugehörige Software-Symbol (siehe Table of Materials) um die Systemsoftwareanwendung (Steuergerät) zu öffnen. Jede Halterung verfügt über ein individuelles Fenster mit verschiedenen Registerkarten zum Festlegen der Versuchsbedingungen, des Zeitintervalls und der Dauer der Impedanzmessung sowie der Datenanalyse.
5. Unter dem Layout<span style='font-family:Arial,sans-serif; Schriftgröße:12pt; font-style:normal; font-variant:normal; Schriftstärke:400; text-dekoration:keine; vertical-align:Grundlinie; white-space:pre-wrap;' > Registerkarte vierfache Vertiefungen für jede biologische Bedingung festlegen und zweistufige Zellimpedanzmessungen unter dem Schedule Registerkarte. Der erste Schritt besteht aus einer einmaligen Basismessung (ein Sweep mit einem Intervall von 1 Minute), und der zweite Schritt besteht darin, die Zellimpedanz in den jeweiligen einzelnen Wiegen für ein tatsächliches Experiment zu messen. Verwenden Sie für die Migration 145 Sweeps mit einem Intervall von 10 Minuten und für die Invasion 577 Sweeps mit einem Intervall von 10 Minuten, die individuell festgelegt werden) in den jeweiligen einzelnen Halterungen.
6. Eine Stunde vor Beginn der Zellimpedanzmessung 160 μl DMEM mit 10 % FBS als Chemoattraktivstoff in die Vertiefungen der unteren Kammer der Platte geben. Montieren Sie entweder die obere Kammer mit den mit ECM-Gel beschichteten Vertiefungen oder die unbeschichteten Vertiefungen mit der unteren Kammer, um die Invasion bzw. Migration zu messen.
7. Füllen Sie die Vertiefungen in der oberen Kammer mit 50 μl niedrigem Serummedium und legen Sie sie in die Halterung des Systems. Überprüfen Sie, ob alle Wells von der Steuereinheit erkannt werden, indem Sie auf die Schaltfläche Message Registerkarte. Wenn die Meldung als OK, ist die Platte in der Wiege bereit für das Experiment.
8. Inkubieren Sie die vollständig gepackten Platten im Inkubator unter Kulturbedingungen für 1 h vor den Messungen in der Halterung des Echtzeit-Zellanalysesystems, was für die Akklimatisierung einer gepackten Platte an die Zellkulturbedingungen unerlässlich ist.
9. Für die Ernte von Zellen, die mit niedrigem Serummedium behandelt wurden, Waschen Sie die in Kulturschalen wachsenden Zellen mit 1x PBS und fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) hinzu. Stellen Sie ihn für 30 s in den Inkubator und entfernen Sie das Trypsin-EDTA. Sammeln Sie Zellen im low serum medium in ein 15-ml-Röhrchen und zähle die Zellen mit einem automatischen Handheld-Zellzähler.
10. Nach dem Zählen zentrifugieren Sie Zellen bei 100 x g für 5 Minuten und verwerfen Sie den Überstand.
11. Resuspendieren Sie 800.000 Zellen in 800 μl niedrigem Serummedium für die Migrations- und Invasionsassays. Zusätzlich resuspendieren Sie 300.000 Zellen in 2 ml Kulturmedium und säen Sie sie in einer 35-mm-Schale für die Western-Blot-Analyse, um den regulierten Knockdown von Crk und CrkL zu bestätigen.

2. Baseline-Lesen, Seeding der Zellen und Messung und Visualisierung der Zellimpedanz

1. Messen Sie den Basislinienwert, indem Sie auf die Wiege klicken Starten Taste. Die Baseline sollte nach einer 1-stündigen Vorinkubation der Platten in der Wiege des Echtzeit-Zellanalysesystems unter Kulturbedingungen im Kohlendioxid-Inkubator und vor der Aussaat der Zellen in die entsprechenden Vertiefungen in der oberen Kammer abgelesen werden.
   NOTE: Einmal die WiegeStart Schaltfläche geklickt wird, fragt das Steuergerät, ob die experimentelle Datei gespeichert werden soll. Nachdem die Datei gespeichert wurde, misst der Cradle-Analysator die Impedanz der Basiszelle, wie sie ursprünglich im Programm eingestellt wurde, und wechselt in einen Pausenmodus, bis die Cradle Start Schaltfläche wird erneut anklickt, um die Zellimpedanz im zweiten Schritt zu messen.
2. Nehmen Sie nach der Basismessung beide Platten für Migration und Invasion aus den Halterungen und bewahren Sie sie in der Biosicherheitswerkbank auf.
3. Aussaat von 100 μl Zellen (100.000 Zellen) in vierfacher Ausführung für jeden biologischen Zustand in der oberen Kammer der CIM-Platte in die jeweiligen Vertiefungen, wie in der Steuereinheit der Wiege durch umgekehrtes Pipettieren programmiert, um Luftblasen zu vermeiden.
4. Bewahren Sie die Platte nach der Aussaat 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter einer Biosicherheitswerkbank auf, damit sich die Zellen gleichmäßig am Boden absetzen können. Übertragen Sie die Platte zurück in die jeweilige Halterung und klicken Sie auf die Startschaltfläche der Halterung, um die Messung der Zellimpedanz zu starten, wie im zweiten Schritt von 1,5 programmiert.
5. Nach dem letzten Sweep ist das Experiment beendet und die Ergebnisse werden automatisch gespeichert.
6. Unter dem Data Analysis Registerkarte können Sie die Änderungen der Zellimpedanz als Zellindex in zeitabhängiger Weise während oder nach Abschluss des Experiments visualisieren. Jede der jeweiligen Bedingungen von Quadruplikaten kann entweder einzeln oder als Durchschnittswerte und/oder Standardabweichungen visualisiert werden, indem Sie auf die Schaltfläche Options Kästchen für Durchschnitts- und Standardabweichung.
7. Um Zellenindexdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren, öffnen Sie eine leere Tabellenkalkulationsdatei, platzieren Sie den Cursor in der Mitte des <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Data Analysis Fenster, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld die Option Daten in List kopieren Format und fügen Sie die Daten in die geöffnete Tabelle ein.
8. Passen Sie die Zeit in den Rohdaten an, um die tatsächliche Startzeit der Zellimpedanzmessung darzustellen. Die Startzeit des zweiten Schritts wird auf Null gesetzt.
   NOTE: Das Steuergerät hat die Möglichkeit, den Zellindex mit oder ohne Normalisierung (d.h. normalisierter Zellindex) zu erhalten und die Ergebnisse als grafische Darstellung zeitabhängig zu visualisieren. In diesem Beispiel werden die Zellenindexdaten ohne Normalisierung zur Verarbeitung und grafischen Darstellung exportiert.
9. Geben Sie das Experiment frei, indem Sie auf die Schaltfläche Release Schaltfläche in jeder Wiege klicken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biosafety bench	ThermoFisher Scientific<
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	302002	Kulturmedium für Zellen verwendet culture
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS zum Waschen der Zellen
Fötales Rinderserum (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i Kohlendioxid-Inkubator	ThermoFisher Scientific<	Kohlendioxid-Inkubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix gel
RTCA software	Abteilung für Zellanalyse von Agilent Technologies, Inc		Instrument für Experimente
Scepter	Millipore	C85360<
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054<
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Für Experimente
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050

td style='width:145pt;'>1300 Serie Klasse II, Typ A2td style='width:145pt;'>51030285td style='width:147pt;'>Handheld automated cell countertd style='width:147pt;'> verwendete Zelllinien