Entwicklung eines translaminaren Druckmodells mit einem translaminaren autonomen System

Abstract

Quelle: Sharma, T. P., et al., Translaminares autonomes Systemmodell für die Modulation des intraokularen und intrakraniellen Drucks in den hinteren Segmenten menschlicher Spender. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Vorbereitung eines menschlichen Auges zur Untersuchung der Auswirkungen des translaminaren Drucks auf die Signalübertragung von retinalen Ganglienzellen durch Simulation des intraokularen und intrakraniellen Drucks in einem translaminaren autonomen System.

Protocol

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Vorbereitung und Sterilisation von Geräten und Verbrauchsmaterialien

1. In der Tabelle der Materialien finden Sie eine vollständige Liste der benötigten Verbrauchsmaterialien sowie Lieferanten- und Katalognummern.
2. Sterilisieren Sie vor dem Gebrauch alle Geräte und Instrumente durch Autoklavieren oder mit Ethylenoxid-Ampullen.

2. Zubereitung von Perfusionsmedium

1. 1 % Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin, 10.000 μg/ml Streptomycin in 0,85 % NaCl) und 1 % L-Glutamin (200 mM) zu 1.000 mL Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt.
2. Sterilisieren Sie das Perfusionsmedium, indem Sie es durch einen 0,22-μm-Filter passieren.

3. Einrichtung des translaminaren autonomen Systems (TAS)

1. Einrichtung von Inflow-Spritzen (Augeninnendruck (IOD) und intrakranieller Druck (ICP))
   1. Geben Sie 30 ml des Perfusionsmediums (Abschnitt 2) in eine 30 ml-Spritze. Befestigen Sie einen 3-Wege-Absperrhahn an der 30-ml-Spritze. Befestigen Sie einen hydrophilen 0,22-μm-Filter an den 3-Wege-Absperrhahn. Befestigen Sie einen 15-G-Luer-Stub-Adapter an dem hydrophilen 0,22-μm-Filter.
   2. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze. Befestigen Sie den Schlauch an den 15-G-Luer-Stub-Adapter. Verschließen Sie die seitliche Öffnung des Absperrhahns mit einer unbelüfteten Universal-Verschlusskappe. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Setups.
   3. Markieren Sie eine Spritze als Kanal 1 intrakranieller Druck (CH1 ICP) und die andere Spritze als Kanal 2 Augeninnendruck (CH2 IOD).
2. Stellen Sie Abflussspritzen (IOD- und ICP-Reservoire) auf.
   1. Befestigen Sie einen 3-Wege-Absperrhahn an einer 30-ml-Spritze. Befestigen Sie einen 15-G-Luer-Stichadapter an den 3-Wege-Absperrhahn. Befestigen Sie den Schlauch an den 15-G-Luer-Stub-Adapter.
   2. Verschließen Sie die seitliche Öffnung des Absperrhahns mit einer unbelüfteten Universal-Verschlusskappe. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Setups. Kennzeichnen Sie eine Spritze als CH1 ICP und die andere Spritze als CH2 IOD.

4. Präparation des menschlichen Ganzaugenglobus

HINWEIS: Wenn ganze Augen empfangen werden, gehen Sie wie folgt vor, um das vordere Segment vom hinteren Augenabschnitt zu trennen. Wenn die Augen halbiert werden, beginnen Sie mit Schritt 4.4.

1. Legen Sie ein ganzes Auge für 2 Minuten in die Povidon-Jod-Lösung.
2. Spülen Sie das Auge in einer sterilen phosphatgepufferten Lösung (PBS), um das Povidon-Jod zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
3. Entfernen Sie die Adnexe mit einer Pinzette und einer Schere vom gesamten Augapfel. Halbieren Sie das Auge am Äquator, um den vorderen und den hinteren Augenabschnitt zu trennen.
4. Entfernen Sie die Sehnervenscheide. Entfernen Sie den Glaskörper aus dem hinteren Segment.
5. Schneiden Sie bei Bedarf zusätzliche Sklera aus dem hinteren Segment ab, um einen guten Sitz auf der runden Kuppel der IOD-Kammer (Boden) zu gewährleisten. Achten Sie mit einer Pinzette darauf, dass die Netzhaut gleichmäßig über den hinteren Teil des Segments verteilt ist.
6. Aufbau der IOD-Kammer (unten)
   1. Platzieren Sie das hintere Segment des Menschen in der IOD-Kammer (unten) des TAS über der runden Kuppel, wobei der Sehnerv nach oben zeigt.
   2. Versiegeln Sie den hinteren Abschnitt mit dem O-Ring aus Epoxidharz mit vier Schrauben, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten.
   3. Stecken Sie den Schlauch in die IN- und OUT-Anschlüsse der IOP-Kammer (unten). Die IOD-Zuflussspritze mit dem Schlauch mit Medium wird in den IN-Anschluss eingeführt, und die leere IOP-Abflussspritze mit Schlauch wird in den OUT-Anschluss eingeführt.
   4. Verwenden Sie die Push/Pull-Methode, um das Perfusionsmedium langsam in die Einströmöffnung zu infundieren, um die hintere Augenmuschel zu füllen, während Sie gleichzeitig das Perfusionsmedium langsam durch die Ausflussspritze herausziehen, um alle Luftblasen von den Leitungen zu entfernen. Beenden Sie das Aufgießen des Mediums, sobald sowohl die IN- als auch die OUT-Röhren frei von Luftblasen sind.
   5. Verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Stellung. Entfernen Sie die 30-ml-Spritze aus der IOP IN-Anschlussfilterbaugruppe und füllen Sie sie mit 30 ml Medium auf. Ersetzen Sie dann die Spritze durch die Filterbaugruppe.
7. Aufbau der ICP-Kammer (oben)
   1. Platzieren Sie die ICP-Kammer/den Deckel (oben) über der Rückseite des hinteren Segments. Stellen Sie sicher, dass sich der Sehnerv in der oberen Kammer befindet. Verschließen Sie die obere Kammer mit vier Schrauben.
   2. Führen Sie den Schlauch in die IN- und OUT-Anschlüsse der ICP-Kammer (oben) ein. Die ICP-Zuflussspritze mit dem Schlauch mit dem Medium wird in den IN-Anschluss eingeführt, und die leere ICP-Auslaufspritze mit Schlauch wird in den OUT-Anschluss eingeführt.
   3. Gießen Sie das Medium vorsichtig und langsam in den IN-Anschluss, um die ICP-Kammer zu füllen und Luftblasen aus den Leitungen mit der Push/Pull-Methode zu entfernen. Beenden Sie die Infusion des Mediums, sobald die ICP-Kammer und sowohl der IN- als auch der OUT-Schlauch frei von Luftblasen sind.
   4. Verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Stellung. Entfernen Sie die 30-ml-Spritze aus der ICP-In-Port-Filterbaugruppe und füllen Sie sie mit 30 mL Medium auf. Ersetzen Sie dann die Spritze durch die Filterbaugruppe.

Materials