Lebendzell-Phagozytose-Assay von Mikroglia-ähnlichen Zellen unter Verwendung humaner Synaptosomen

Zusammenfassung

Quelle: Funes, S., et. al., Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay unter Verwendung humaner Synaptosomen. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der phagozytischen Kapazität von Mikroglia-ähnlichen Zellen unter Verwendung von pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff-markierten Synaptosomen.

Protokoll

1. Lebendzell-Phagozytose-Assay
   1. Platten 20-30 × 10⁴ PMPs in 96-Well-Platten in 100 μl iMG vollständiges Medium abfüllen und den Differenzierungsprozess 10 Tage lang verfolgen.
   2. Bereiten Sie am Tag des Assays die Kernfärbelösung vor, indem Sie 1 Tropfen einer Kernfärbung für lebende Zellen in 2 mL iMG Basalmedium geben.
   3. Entfernen Sie 40 μl Medium pro Vertiefung der 96-Well-Platte und fügen Sie 10 μl der nuklearen Färbelösung mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Die Platte bei 37 °C und 5 % CO₂ 2 h inkubieren.
   4. Tauen Sie die markierten Synaptosomen auf Eis auf und beschallen Sie sie vorsichtig mit einem Wassersonicator für 1 Minute. Übertragen Sie die Synaptosomen sofort zurück auf Eis. Verdünnen Sie die markierten Synaptosomen in iMG Komplettmedium in einem Verhältnis von 1 μl Synaptosomen pro 50 μl des Mediums.
      HINWEIS: Die Konzentration des Synaptosoms ist Assay-abhängig und muss möglicherweise optimiert werden. Um einen relativ niedrigen Prozentsatz (d. h. 0,1 % oder weniger) an DMSO im Medium aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, nicht mehr als 2 μl Synaptosomen pro Vertiefung hinzuzufügen.
   5. Als Negativkontrolle einige Vertiefungen mit Cytochalasin D vorbehandeln, um die Aktinpolymerisation und damit die Phagozytose zu hemmen. Bereiten Sie eine Lösung von 60 μM Cytochalasin D in iMG Komplettmedium vor. Geben Sie 10 μl dieser Lösung in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erreichen, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C_und 5 % CO 2.
   6. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 10 °C. Halten Sie die Platte auf Eis und fügen Sie 50 μl Medium hinzu, das Synaptosomen enthält.
   7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 × g für 3 min bei 10 °C und halten Sie die Platte bis zur Bildaufnahme auf Eis.
2. Imaging acquisition and analysis
   1. Setzen Sie die Platte in ein Bildgebungsgerät für lebende Zellen ein und wählen Sie die zu analysierenden Wells aus.
   2. Wählen Sie ein 20x Objektiv aus.
   3. Passen Sie den Fokus, die Intensität der Leuchtdiode (LED), die Integrationszeit und die Verstärkung der Hellfeld- und Blaukanäle (4',6-diamidino-2-phenylindol [DAPI]) an. Die Synaptosomenfluoreszenz sollte zum Anfangszeitpunkt vernachlässigbar sein. Verwenden Sie den Hellfeldkanal als Referenz, um sich auf den roten Kanal (RFP) zu fokussieren. Die Integrationszeit und der Gewinn können zwischen den Experimenten variieren. Verwenden Sie diese Grundeinstellungen für den roten Kanal: LED: 4, Integrationszeit: 250 und Verstärkung: 5.
   4. Wählen Sie die Anzahl der einzelnen Kacheln aus, die in einer Montage pro Vertiefung erfasst werden sollen (z. B. erfassen Sie 16 Kacheln in der Mitte der Vertiefung, wodurch etwa 5% der gesamten Vertiefungsfläche abgebildet werden). Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und das gewünschte Zeitintervall für die Bildgebung ein.
      HINWEIS: Die Bilder wurden in dieser Studie alle 1 - 2 Stunden für bis zu 16 Stunden aufgenommen.

Materialien

Komponenten des iMG-Basismediums

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cell culture materials
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning<
CellAttach Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	Bezogen auf laminin 521<
Advanced DMEM/F12<	12634010	Endkonzentration 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	Endgültige Konzentration 1x
N2 Ergänzung, 100x	Gibco	17502-048	Endkonzentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco<	Endkonzentration 100 U/mL
Komponenten von iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023<
IL-34	PeproTech oder Biologend	200-34 oder 577904	Endkonzentration 100 ng/mL
iMG base media			Endkonzentration 1x
M-CSF	PeproTech	300-25<
TGF-β	PeproTech	100-21	Endkonzentration 50 ng/mL
Phagozytose-Assay-Farbstoffe
NucBlue Live Ready reagenz	Invitrogen	R37605<
pHrodo Red, Succinimidylester	ThermoFisher Scientific<
Andere Zellkultur-Reagenzien
Cytochalasin D	Sigma style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>	Endkonzentration 10 μM
Software und Ausrüstung
Centrifuge<	Model 5810R
Cytation 5 Live-Cell Imaging Reader	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	Version 3.03

td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>353872td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'><td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Gibcotd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>15140122td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Endkonzentration 55 μMtd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Endkonzentration 5 ng/mLtd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>P36600<td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Bezieht sich auf pH-empfindliche Farbstoffetd style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Eppendorf