Nachweis des phosphorylierten neuronalen Kalium-Chlorid-Cotransporters 2 mittels Western Blotting

Zusammenfassung

Quelle: Josiah, S. S., et al. Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting. J. Vis. exp. (2022).

Das Video zeigt die Schritte zum Nachweis und zur Quantifizierung des phosphorylierten Kaliumchlorid-Cotransporter-2-Proteins (KCC2) in einem Zelllysat. Dieser Prozess umfasst Immunpräzipitation, um phosphoryliertes KCC2 zu isolieren, und Chemilumineszenz, um das isolierte Protein zu quantifizieren.

Protokoll

1. Zellkultur und Transfektion

1. Alle Reagenzien vor dem Zellkulturverfahren im Bead-Bad (37 °C) erwärmen. Bereiten Sie das Nährmedium vor, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, je 1 % 2 mM L-Glutamin, 100x nicht-essentieller Aminosäure, 100 mM Natriumpyruvat und 100 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin.
2. Tauen Sie stabil transfizierte KCC2b-Zellen der menschlichen embryonalen Niere der Ratte (HEK293^rnKCC2b) vollständig im Perlenbad (37 °C) auf. Übertragen Sie die Zellen aus dem Kryoröhrchen in ein Zentrifugenröhrchen mit 5 mL frischem Medium. Drehen Sie die Zelle bei 1200 ×g für 3-5 min.
3. Verwenden Sie eine Aspiratorpipette (an einer Vakuumpumpe befestigt), um den Überstand abzusaugen, und fügen Sie 10 ml frisches Medium hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 10 cm große Schalenplatte.
4. Stellen Sie die Schale in den Inkubator und lassen Sie sie 48 Stunden lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ wachsen. Überwachen Sie die Inkubationszeit, um ein gesundes Zellwachstum zu gewährleisten. Teilen Sie die Zellen weiter auf, wenn sie nach der Inkubationszeit eine Konfluenz von über 90 % erreicht haben.
5. Aspirieren Sie das Altmedium aus der Zellschale und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 2 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) aus. 2 ml Trypsin zugeben und ca. 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Verwenden Sie 2 ml vollständiges Medium, um die trypsinisierten Zellen vorsichtig in der Schale zu waschen. Geben Sie 9 ml frisches Medium in neue Schalen und geben Sie 1 ml Lösung aus der alten Schale in jede der neuen Schalen. Bringen Sie die Split-Cell-Schalen für 48 Stunden zurück in den Inkubator, um ≥ Konfluenz von 90 % zu erreichen.
7. Behandeln Sie die Zellen entweder mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kontrolle, 8 μM Staurosporin oder 0,5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) für 15 Minuten, bevor Sie die Zellen in Lysepuffer ernten.

2. Vorbereitung der Zelllysate und Laden von Proben

1. Aspirieren des Mediums auf der Kulturschale (aus Transfektionsverfahren). Legen Sie die Zellkultur auf Eis und waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS.
2. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie dann 1,0 ml eiskalten Lysepuffer hinzu, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-TETRAESSIGSÄURE (EGTA), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 10 mM Natrium-β-glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 % (w/v) Triton X-100, 0,27 M Saccharose, 1 mM Benzamin, 0,1 % (v/v) 2-Mercaptoethanol und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in die Schale.
   HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers während der Zellernte variiert je nach Schalengröße, z. B. ist 1 ml Lysepuffer pro 1 x 10⁷ Zellen/100 mm Schale/150 cm² Kolben geeignet, während 0,5 ml pro 5 x 10⁶ Zellen/60 mm Schale/75 cm² Kolben geeignet sind.
3. Kratzen Sie die Zellen mit einem kalten Kunststoffschaber vom Boden der Schale ab und geben Sie die Zellsuspension dann vorsichtig mit einer Pipette in ein bereits auf Eis befindliches Mikrozentrifugenröhrchen. Rühren Sie das Röhrchen 30 min lang konstant bei 4 °C.
4. Schleudern Sie die Zelllysate in einer kalten Zentrifuge (4 °C) bei 16.000 x g für 20 min, nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und legen Sie es auf Eis. Sammeln Sie den Überstand in ein vorgekühltes Frischröhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
   HINWEIS: Je nach Zelltyp kann es notwendig sein, die Zentrifugationskraft und -zeit zu variieren. Die allgemeinen Richtlinien empfehlen jedoch eine Zentrifugation bei 16.000 x g für 20 Minuten. Dies muss jedoch bei jedem Versuch ermittelt werden. Zum Beispiel benötigen empfindliche Zellen wie Leukozyten eine sehr geringe Zentrifugationsgeschwindigkeit.

3. Herstellung von Immunfällungsmitteln aus Zelllysaten

1. Pipettieren Sie 300 μL Protein-G-Sepharose in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Schleudern Sie die Lösung bei 500 x g für 2 min und verwerfen Sie den Überstand.
2. Fügen Sie 500 μl PBS hinzu und wirbeln Sie die Lösung gut ein. Schleudern Sie die Lösung bei 500 x g für 2 min und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt.
3. Mischen Sie 1 mg Anti-KCC2 Thr906 und Anti-KCC2 Thr1007 Antikörper mit 200 μl Protein G-Sepharosekügelchen und füllen Sie das Volumen auf 500 μl mit PBS auf. Auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad 2 h bei 4 °C schütteln. 2x mit PBS waschen.
4. Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Ganzzelllysaten durch und fügen Sie 1 mg des Zelllysats zu den gewaschenen Kügelchen hinzu. In einem durchgehenden Rotator 2 h bei 4 °C schonend inkubieren. Die Kügelchen herunterschleudern und 3x mit PBS waschen, das 150 mM Natriumchlorid (NaCl) enthält.
5. Immunpräzipitantien (Kügelchen) 3x mit 200 μL PBS waschen. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 100 μl 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Probenpuffer.
6. Schütteln Sie die Röhrchen in einem Rotorschüttler bei Raumtemperatur für 5 min und inkubieren Sie sie in einem Heizblock bei 75 °C für 10 min. Zentrifugieren Sie die Ladeprobe bei 11.000 x g für 2 Minuten und verwenden Sie den Überstand zum Laden des Gels.

4. Durchführung des Western Blots

1. Bauen Sie die Gießapparatur zusammen und gießen Sie frisch zubereitetes 8%iges Trenngel (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um das Gel zu gießen, wobei Sie etwa 2 cm Abstand von der Oberseite des Gießglases lassen. Geben Sie 200 μl absolutes Isopropanol in den Aufbau und lassen Sie ihn 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.
   HINWEIS: Das Polyacrylamid-Gel-Rezept für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hängt von der Größe des interessierenden Proteins ab (Tabelle 2). Notieren Sie sich daher die Proteingröße, bevor Sie den gewünschten Gelanteil bestimmen.
2. Entfernen Sie das Isopropanol mit einer Pipette und spülen Sie das Gel vorsichtig mit ca. 200 μl destilliertem Wasser aus. Frisch zubereitetes 6%iges Stapelgel hinzufügen (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um den ca. 2 cm großen Platz auf der Gießaufstellung aufzufüllen. Vorsichtig in den gut gefüllten Kamm legen und 30 Min. bei Raumtemperatur ziehen lassen.
3. Das gegossene Gel in den Elektrophoresetank fixieren.
4. Löse 30,3 g Trisbase, 144,1 g Glycin und 10 g SDS in 1000 ml destilliertem Wasser auf, um einen 10x Transferpuffer herzustellen. Bereiten Sie 1x Laufpuffer vor, indem Sie 10 mL 10 % SDS und 100 mL 10x Transferpuffer zu 890 mL destilliertem Wasser hinzufügen.
5. Gießen Sie 1x Laufpuffer in den Tank. Laden Sie 5 μl Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels (zwischen 18 und 30 μl, je nach verwendeter Wabengröße). Füllen Sie leere Vertiefungen mit 1x LDS und lassen Sie das Gel ca. 90-120 min bei 120 V laufen.
6. Lösen Sie 58,2 g Tris-Base und 29,3 g Glycin in 1000 mL destilliertem Wasser, um 10x Transferpuffer herzustellen. Aktivieren Sie die Nitrozellulosemembran mit 1x Transferpuffer mit 20% Methanol. Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel.
   HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, den pH-Wert der laufenden und Transferpuffer anzupassen, da sie den optimalen pH-Wert haben sollten. Außerdem ist es ratsam, diese Puffer vor dem Experiment vorzubereiten und bei Raumtemperatur zu lagern, um Zeit zu sparen.
7. Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an: negative Elektrode (schwarzer Rahmen/Ende) - Sandwichschaum - Filterpapier - gespültes SDS-PAGE-Gel - gespülte Nitrozellulosemembran - Filterpapier - Sandwichschaum - positive Elektrode (roter Rahmen). Stapeln Sie das zusammengebaute Sandwich in den Transferbehälter und betreiben Sie es mit 90 V für 90 min oder 30 V für 360 min.

5. Antikörperfärbung und Bildentwicklung

1. Entfernen Sie die Membran und lassen Sie sie trocknen. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Blockierungspuffer aus 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,1 % 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Verdünnungen von Primärantikörper^8,15,19 und Beta-Aktin (Beladungskontrolle) in Blockierungspuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Membran in drei Wäschen mit 1x TBS-T für jeweils 5 min.
   HINWEIS: Die Inkubation der separaten Membran mit Beladungskontrollen wie Beta-Aktin, Alpha-Tubulin oder Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Antikörpern dient dazu, die anderen Western-Blotting-Ergebnisse während der nachfolgenden Quantifizierung zu normalisieren. Die empfohlene Verdünnung für jeden Primärantikörper ist im Handbuch des Herstellers verfügbar.
3. Die gewaschene Membran wird mit einem 5000-fach in Blockierungspuffer verdünnten Sekundärantikörper 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Auch hier die Membran 3x in 1x TBS-T für je 5 min waschen.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, den Sekundärantikörper gegen die Spezies zu erhöhen, bei der der Primärantikörper aufgezogen wurde. Wenn beispielsweise der primäre Antikörper von Gesamt-KCC2 Maus-Anti-KCC2 ist, muss der sekundäre Antikörper für Anti-Maus verwendet werden.
4. Legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildplatine. Mischen Sie gleiche Volumina jedes Reagenzes für die verstärkte Chemilumineszenz (ECL) und verteilen Sie die gemischte Lösung vorsichtig auf der Membran, um Signale zu entwickeln.

6. Bildaufnahme mit einem Bildgebungssystem und Datenquantifizierung

1. Übertragen Sie die Speicherplatine für die Bildgebung in das entsprechende Fach des Bildgebungssystems. Öffnen Sie die Imaging-Software auf dem Computer für die Bildverarbeitung.
2. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Neues Protokoll und wählen Sie Single Channel aus. Klicken Sie auf Auswählen im Dialogfeld für Gelbildgebung/Anwendung, scrollen Sie zu Blot und wählen Sie entweder Chemi Hi Sensitivity oder Chemi Hi Resolution. Klicken Sie dann auf Signal Accumulation Setup, um die Dauer und Anzahl der aufzunehmenden Bilder festzulegen.
3. Klicken Sie unter Protokolleinrichtung auf Gel positionieren und passen Sie das Gel bei Bedarf im Bildgebungssystem an. Klicken Sie auf Protokoll ausführen, um die Bilder zu erfassen.
4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der erfassten Bilder unter dem Feld Imaging-Katalog, um die Bilder auf dem Computer zu speichern. Navigieren Sie zum gewünschten Bild und klicken Sie auf Bild auswählen und fortfahren unter dem Dialogfeld Ausführen.
5. Klicken Sie auf das Symbol Image Transform, um den Kontrast und die Pixelsättigung des Bildes anzupassen. Klicken Sie auf das Symbol Screenshot in der allgemeinen Symbolleiste, um das Bild je nach gewünschtem Bildformat auf dem Computer zu speichern.
6. Messen Sie die Bandendichten mit der ImageJ-Software und analysieren Sie sie mit geeigneten Statistikwerkzeugen.

Ergebnisse

Tabelle 1: Rezept zur Herstellung einer Polyacrylamid-Gelmischung (Trennen und Stapeln von Gellösungen).

8 ml 8% Trenngel

Materialien