$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
1. Quantifizierung von retinalen Ganglienzellen somas
HINWEIS: Das folgende Verfahren dient der Quantifizierung von RGC-Somen, basierend auf der immunhistochemischen Färbung von retinalen Flat-Mounts mit einem Antikörper gegen das gehirnspezifische Homöobox/POU-Domänenprotein 3A (Brn3a).
- Übertragen Sie isolierte Netzhaut in eine 24-Well-Kulturplatte (eine Netzhaut pro Well), die 1 ml 1x PBS enthält, und halten Sie die innere Netzhaut nach oben.
- Permeabilisieren Sie Gewebe, indem Sie 3x für 10 min mit einem nichtionischen Tensid 0,5% verdünnt in 1x PBS (0,3 mL) waschen. Lassen Sie dann das Gewebe 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in 5 % Rinderserumalbumin (BSA), in nichtionischem Tensid 2 % und 1x PBS (Blockierungslösung; 0,25 mL) sanft schütteln.
- Während Schritt 1.2 bereiten Sie die Brn3a-Primärantikörperlösung vor, indem Sie sie 1:200 in nichtionischem Tensid 0,5% und 1x PBS plus 5% BSA verdünnen und bei 4 °C lagern.
- Nach 60 Minuten Gewebeblockierung die Netzhaut in 0,2 ml Primärantikörperlösung bei 4 °C für 72 h unter leichtem Schütteln inkubieren.
- Waschen Sie das Gewebe 3x für 10 min mit 1x PBS, dann inkubieren Sie das Gewebe für 2 h bei Raumtemperatur in 0,2 mL der sekundären Antikörperlösung, verdünnt 1:750 in 1x PBS plus 5% BSA.
- Inkubieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang in nuklearer Gegenfärbelösung für die Fluoreszenz-Kernfärbung. Schließen Sie die Immunhistochemie mit einem abschließenden Waschschritt mit 1x PBS (0,3 mL) ab, der 3x wiederholt wird.
- Übertragen Sie Netzhäute mit Hilfe von zwei kleinen Pinseln auf Glasobjektträger, wobei Sie die Glaskörperseite nach oben halten. Positionieren Sie den dorsalen Netzhautquadranten nach oben auf den Objektträgern. Machen Sie zwei weitere radiale Schnitte in Richtung des Sehnervenkopfes, um die anderen 3 Quadranten (nasal, ventral und temporal) abzugrenzen.
HINWEIS: Die Schnittmaße sind nicht festgelegt. Sie sollten nicht zu kurz sein, was eine effiziente Abflachung der Netzhaut auf dem Objektträger beeinträchtigt, und nicht zu lang sein, damit sie das Foramen des Sehnervs erreicht und den abgegrenzten retinalen Quadranten vollständig vom restlichen Gewebe trennt. - Tragen Sie abschließend 0,2 mL Antifading-Eindeckmedium auf ein Glasdeckglas auf und legen Sie dieses auf die flach montierte Netzhaut für die gewebemikroskopische Analyse. Um die RGCs-Dichte zu schätzen, untersuchen Sie die flachen Montierungen unter einem konfokalen Epifluoreszenzmikroskop mit einem 40x/1,3-Objektiv
.- Für jeden Quadranten der Netzhaut nimmst du acht Fotos auf: zwei von der zentralen Netzhaut (~0,9 mm von der Sehscheibe), drei von der mittleren Netzhaut (~2,0 mm von der Sehscheibe) und drei von der peripheren Netzhaut (~3,7 mm von der Sehscheibe), insgesamt also 32 Fotos pro Netzhaut. Verwenden Sie die FIJI-Software, um Brn3a-positive Zellen zu zählen und die mittlere Zelldichte zu schätzen.