Das Video zeigt eine ex vivo-Technik zur Stimulation des intrakardialen Nervensystems, um die Anfälligkeit des Herzens für Herzrhythmusstörungen zu beurteilen. Mit Hilfe eines Perfusionsapparaturs wird ein isoliertes Mausherz mit einem sauerstoffhaltigen Puffer perfundiert. Das intrakardiale Nervensystem wird dann mit hoher Frequenz stimuliert, um Herzrhythmusstörungen zu induzieren.
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Methodenartikel
Stimulation des intrakardialen Nervensystems zur Beurteilung der Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung des Langendorff-Apparats
HINWEIS: Es wird ein kommerziell erhältliches Langendorff-Perfusionssystem verwendet.
- Bereite eine modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung vor (119 mM Natriumchlorid, 25 mM Natriumbicarbonat, 4,6 mM Kaliumchlorid, 1,2 mM Kaliumphosphat monobasisch, 1,1 mM Magnesiumsulfat, 2,5 mM Calciumchlorid, 8,3 mM Glukose und 2 mM Natriumpyruvat). Um eine Kalkfällung zu verhindern, geben Sie ein Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid in die Perfusionslösung. Filtern Sie den Puffer mit einer Porengröße von 0,22 μm.
- Füge dem Puffer einen pharmakologischen Wirkstoff hinzu, um seine Wirkung auf die kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenese nach Bedarf zu untersuchen.
- Starten Sie das Wasserbad und geben Sie die Perfusionslösung mit einer Mischung aus 95% Sauerstoff/5% Kohlendioxid hinein. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass die Temperatur der Perfusionslösung direkt vor der Kanüle ~37 °C beträgt.
- Sobald die richtige Temperatur erreicht ist, starte die Rollenpumpe und fülle das Gerät mit der Perfusionslösung.
- Passen Sie die Pumprate an, bevor Sie das Herz anbringen, so, dass keine Luftblasen in der Kanüle zurückbleiben, wenn Sie es am Gerät montieren.
2. Hard- and Software Preparation
- Verbinden Sie ein digitales Datenerfassungssystem und die dazugehörige Software mit dem Langendorff-Gerät für eine kontinuierliche Aufzeichnung des Perfusionsdrucks, der Flussrate und der Herzfrequenz.
- Stellen Sie den angestrebten Perfusionsdruck in den allgemeinen Einstellungen auf 80 mmHg ein.
- Aufnahme starten.
- Für die Datenaufzeichnung und Stimulation mit einem speziellen digitalen Stimulusgenerator verwenden Sie einen elektrophysiologischen Katheter mit Platinelektroden, einer Elektrodenfläche von 0,5 x 0,5 mm und einem Elektrodenabstand von 0,5 mm.
- Platzieren Sie den Katheter in der Nähe des Bereichs, in dem das Herz nach der Befestigung am Gerät positioniert wird.
- Bereiten Sie die Stimulation vor, indem Sie 2 Elektroden aus dem Katheter auswählen und eine Zykluslänge von 100 ms verwenden.
3. Zubereitung des Heart
- Den kalten (~2 - 4 °C) Perfusionspuffer (10 - 20 mL und 40 - 50 mL, so dass die ganze Schale bedeckt ist) zu den 2 Petrischalen (Durchmesser 6 cm und 10 cm) und der Schale mit der Kanüle geben und direkt neben und unter dem Mikroskop auf Eis legen. Bereiten Sie einen Doppelknoten um die Kanüle vor.
- Schnelles Entfernen des Herzens nach zervikaler Luxation, indem der Thorax mit einer Mayo-Schere und einer Pinzette mit schmalem Muster geöffnet wird. Fassen Sie dann die Aorta und die Hohlvene mit der Londoner Pinzette über dem Zwerchfell und entfernen Sie den Herz-Lungen-Block, indem Sie alle Gefäße und das Bindegewebe in der Nähe der Wirbelsäule mit der Strabismus-Schere durchtrennen.
- Übertragen Sie den Herz-Lungen-Block in die erste Schale (6 cm Durchmesser), die mit dem eiskalten Puffer gefüllt ist, und entfernen Sie vorsichtig die Lunge, ohne das Herz mit einer Strabismus-Schere und einer Londoner Pinzette zu beschädigen. Legen Sie dann das Herz unter das Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig den Thymus, die Speiseröhre und die Luftröhre mit einer Federschere und einer Dumont SS-Pinzette.
- Schneide mit der Federschere ein 1,5 - 2 mm großes Loch in den oberen Teil des rechten Vorhofs für das Einführen des Katheters. Schneide ein Loch in die Lungenarterie. Schneiden Sie dann die Aorta direkt unter den supraaortalen Ästen ab und entfernen Sie das Gewebe, damit der Knoten leicht befestigt werden kann.
- Halten Sie die atrialen Fettpolster, einschließlich der großen atrialen Ganglionated Plexi, um den linken Vorhof herum intakt oder entfernen Sie sie vollständig durch vorsichtiges Sezieren.
- Übertragen Sie das Herz mit der Kanüle auf die Schale und legen Sie es unter das Mikroskop. Ziehen Sie die Aorta mit der Dumont SS Pinzette über die Kanüle und binden Sie den vorbereiteten Knoten fest um die Aorta. Achten Sie darauf, dass die Kanüle nicht zu tief in der Aorta platziert wird, so dass die Aortenklappe und die Herzkranzgefäße frei bleiben.
- Befestigen Sie die Kanüle schnell am Langendorff-Gerät. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen mehr in der Kanüle befinden.
- Schalten Sie den Perfusionsdruck auf 80 mmHg um, um eine konstante Druckperfusion zu ermöglichen.
- Führen Sie den Katheter vorsichtig in den rechten Vorhof und den rechten Ventrikel ein, ohne das Herz zu berühren oder zu beschädigen, und befestigen Sie ihn mit Klebeband an der Kanüle.
- Starten Sie die Stimulation mit der vorbereiteten Zykluslänge von 100 ms für eine anfängliche Äquilibrierungsphase von 20 Minuten.
- Schließen Sie die Kammer, um eine stabile Temperatur zu ermöglichen.
4. Elektrophysiologische Parameter und Arrhythmogenese
- Wenden Sie eine programmierte Stimulation über die distalen oder proximalen Elektroden des Katheters bei doppelter atrialer oder ventrikulärer Stimulationsschwelle an, um die elektrophysiologischen Parameter zu bewerten, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
- Bestimmen Sie die Sinusknoten-Erholungszeit als maximale Rückkehrzykluslänge nach 10 s fester Stimulation bei einer S1S1-Zykluslänge von 120 ms, 100 ms und 80 ms.
- Bestimmen Sie den Wenckebach-Punkt als längste S1S1-Zykluslänge (8 Stimuli; S1S1: 100 ms; 2 ms stufenweise Reduzierung) mit einem Verlust von 11 AV Knotenleitung. Bestimmen Sie die atrioventrikulären Nodalrefraktärperioden als längste S1S2 (12 Stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms und 100 ms; B. ein kurzer gekoppelter Extrastimulus mit einer schrittweisen S1S2-Reduktion von 2 ms mit einem Verlust der AV-Knotenleitung.
- Bestimme die atrialen und ventrikulären Refraktärperioden als längste S1S2 (12 Stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms und 100 ms; B. ein kurzer gekoppelter Extrastimulus mit einer schrittweisen S1S2-Reduktion von 2 ms) mit einer fehlenden atrialen oder ventrikulären Reaktion.
- Führen Sie eine programmierte Extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms und 80 ms, gefolgt von bis zu 3 zusätzlichen Schlägen; 60 - 20 ms mit einer schrittweisen Reduzierung um 2 ms) oder Burst-Pacing-Protokolle (5 s bei S1S1: 50 - 10 ms mit einer schrittweisen Reduzierung um 10 ms) in Übereinstimmung mit den Lambeth-Konventionen durch, um die ventrikuläre Arrhythmogenese zu bewerten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Sodium chloride | |||
| Natriumhydrogencarbonat | |||
| Kaliumchlorid | |||
| Kaliumphosphat monobasic< | |||
| Magnesiumsulfat-Heptahydrat< | |||
| Calciumchlorid-Dihydrat< | |||
| Glucose | |||
| Natriumpyruvat bioXtra | |||
| Carbogen (95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid)< | |||
| Sterilfilter steritop-GP 0.22 | |||
| Perfusion system | |||
| Datenerfassungssystem und entsprechende Software für Katheter und physiologische Parameter | |||
| Octapolar catheter | |||
| Stimulus generator | |||
| Stimulationssoftware< | |||
| Plastic Wrap | |||
| Federschere< | |||
| Strabismus Scissors | |||
| Mayo Scissors< | |||
| Dumont SS Forceps | |||
| London Forceps | |||
| Narrow Pattern Forceps |
