Dieses Video zeigt das Verfahren zur Induktion einer geschlossenen Kopfverletzung in einem Mausmodell unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens. Der kontrollierte Aufprall repliziert eine leichte traumatische Hirnverletzung und ermöglicht es den Forschern, neurologische Auswirkungen und die Genesung zu untersuchen, indem sie die Reflexe und das Verhalten nach der Verletzung messen.
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Methodenartikel
Induktion eines leichten Schädel-Hirn-Traumas in einem Mausmodell
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Chirurgischer Eingriff
- Befestigen Sie die Maus mit leichten, spitz zulaufenden Ohrbügeln aus Acetalharz, einem Beißstab und einer Mausanästhesiemaske im stereotaktischen Rahmen (siehe Abbildung 1G, H). Das Isoflurangas wird mit 2%-3% in die Raumluft bei 100-200 mL/min abgegeben. Überwachen Sie die Atmung der Maus sorgfältig, um die Narkosetiefe sicherzustellen und den Gasgehalt nach Bedarf anzupassen.
- Tragen Sie steriles Augengleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Sterilisieren Sie die Kopfhaut dreimal mit Povidon-Jod-Tupfern und sterilen Alkoholpads.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus tief betäubt ist, indem Sie sicherstellen, dass keine Zehenkneifreaktion auftritt.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen etwa 1 cm langen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut zwischen Augen und Hals und legen Sie den Schädel frei (siehe Abbildung 1I).
- Lassen Sie den Schädel 1-2 Minuten trocknen.
- Identifizieren Sie Bregma (den Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähte) und Lambda (den Schnittpunkt der sagittalen und lambdoiden Nähte) (siehe Abbildung 1J).
HINWEIS: Ein Atlas des Mausgehirns könnte als Referenz verwendet werden. - Platzieren Sie die Kopfstütze unter dem Kopf und blasen Sie die Glühbirne mit Wasser auf, bis sie gegen die Unterseite des Mauskopfes drückt, aber den Kopf nicht von der Beißstange weghebt.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um mögliche Ohrprobleme durch die geschlossene Kopfverletzung (CHI) zu reduzieren. Jedes Tier, dessen Ohr durch die Ohrstangen geschädigt wird, was zu Rollen oder Blutungen führt, sollte aus der Studie ausgeschlossen und eingeschläfert werden. - Schieben Sie den Schlagkörper über den Kopf des Tieres.
- Verlängern Sie den Impaktor, indem Sie den Kippschalter Extend/Retract (am Steuerkasten des Impaktors) auf den Extend setzen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze vollständig ausgefahren ist, indem Sie die Spitze nach unten ziehen. - Richten Sie den Impaktor so aus, dass er über dem Bregma zentriert ist (siehe Abbildung 1K).
- Setzen Sie die digitalen stereotaktischen x- und y-Koordinaten im stereotaktischen Lesegerät auf 0 zurück (auf der Touchscreen-Steuerung)
- Richten Sie die Sonde über der Aufprallstelle aus, indem Sie die Sonde vom Bregma auf die Zielkoordinaten bewegen: medial-lateral = 0,0 mm, anterior-posterior = −1,6 mm.
- Befestigen Sie den Kontaktsensor am Ohr des Tieres.
- Senken Sie die Sondenspitze mit der ausgefahrenen Sonde langsam ab, bis der erste Kontakt mit der Oberfläche hergestellt ist. Stoppen Sie beim Piepton.
- Setzen Sie die digitalen stereotaktischen Z-Koordinaten im stereotaktischen Lesegerät auf 0 zurück.
- Prüfen Sie genau, ob die Spitze bündig mit dem Schädel abschließt (medial-laterale und anterior-hintere Ebene).
HINWEIS: Die Positionierung der Sondenspitze ist der wichtigste Schritt dieses Prozesses, um Schädelfrakturen und Ohrschäden zu vermeiden. - Ziehen Sie den Prallbrecher ein, indem Sie den Kippschalter an der Steuerbox in die Position Rückzug bringen. Die Spitze zieht sich zurück und hat bis zum Zeitpunkt des Aufpralls keinen Kontakt mehr mit dem Kopf des Tieres.
- Stellen Sie die Aufpralltiefe ein, indem Sie die dorsal-ventrale Tiefe auf −1,2 mm einstellen.
HINWEIS: Die Tiefe des Aufpralls beeinflusst die Schwere der Verletzung. Die Tiefe sollte für unterschiedliche Altersstufen, Gewichte und Stämme von Mäusen auf die gewünschte Verletzungsschwere getaktet werden. Die Tiefe muss möglicherweise im Laufe der Zeit angepasst/neu getitert werden, um eine gleichbleibende Schwere der Verletzung aufrechtzuerhalten. Der Schweregrad kann neuropathologisch beurteilt werden: Mikroglia und Astrozyten (Immunhistochemie (IHC)) und verhaltensbezogen: das Wasserlabyrinth des Radialarms und der aktive Vermeidungstest. - Überwachen Sie die Atmung der Maus sorgfältig, um die Anästhesietiefe sicherzustellen und den Gasgehalt nach Bedarf anzupassen.
HINWEIS: Oft sollte der Anteil an Isoflurangas für 10-20 s vor dem Aufprall gesenkt oder abgeschaltet werden. Achten Sie genau darauf, dass sich die Atmung leicht beschleunigt. Wenn die Atmung zum Zeitpunkt des Aufpralls zu langsam ist, kann das Tier innerhalb der ersten 60 s nach dem Aufprall an Apnoe sterben. Dies kann verhindert werden, indem die Narkosetiefe in den Sekunden vor dem Aufprall angepasst wird. - Lösen Sie den Aufprall aus, indem Sie den rechten Kippschalter auf impact drücken. Die Sondenspitze geht mit der angezeigten Geschwindigkeit nach unten, bleibt dann für die eingestellte Verweilzeit unten und zieht sich zurück.
HINWEIS: Scheinmäuse erhalten die gleiche Behandlung wie die CHI-Mäuse, aber die Wirkung wird nicht geliefert. - Starten Sie den Timer sofort nach dem CHI-Aufprall, um die Aufrichtzeiten aufzuzeichnen (Zeit bis zur Rückkehr von der Seitenposition in die Bauchlage) oder starten Sie den Timer, wenn die Maus für die Scheinmäuse aus dem stereotaktischen Rahmen entfernt wird. Die durchschnittliche Zeit des Aufrichtreflexes beträgt 5-15 Minuten.
HINWEIS: Die Zeiten des Aufrichtreflexes können je nach Belastung und Alter der Maus variieren. - Untersuchen Sie die Mäuse auf sichtbare Schädelfrakturen, Blutungen und Apnoe. Die Mäuse mit einer eingedrückten Schädelfraktur oder sichtbaren Blutung sind aus der Studie auszuschließen.
HINWEIS: Es gibt abgestufte Stufen von Schädelfrakturen. Tiere mit dekomprimierten Schädelfrakturen, bei denen der Knochen sichtbar in das Hirngewebe drückt, werden eingeschläfert (CO2 zuerst, und als sekundäre Methode wird die Enthauptung eingesetzt). Wenn die Schlagkörperspitze richtig eingestellt ist, sind diese Arten von Schädelfrakturen äußerst selten. Wenn es zu einer Schädelfraktur kommt, ist die häufigere Darstellung ein kleiner Blutstropfen auf dem Schädel und eine leichte taktile Rauheit des Schädels, oft entlang der Naht, die die hintere Spitze des Nasenbeins verbindet. Diese Mäuse sind in den Aufzeichnungen als mögliche Schädelfrakturen vermerkt, werden aber normalerweise nicht von der Studie ausgeschlossen. - Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Schließen Sie die Kopfhaut, indem Sie die Haut zusammenheften.
HINWEIS: Resorbierbare oder nicht resorbierbare Nähte können verwendet werden, um die Kopfhaut als Alternative zu Klammern zu schließen. - Tragen Sie eine dreifache antibiotische Salbe mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze auf den geschlossenen Schnitt auf.
- Setzen Sie die Maus zur Wiederherstellung wieder in einen sauberen Haltekäfig ein. Die Hälfte des Rückgewinnungskäfigs befindet sich auf einem Heizkissen (niedrige Einstellung), das die Möglichkeit bietet, sich im Wachzustand von der Hitze zu entfernen und die Temperatur des Tieres zu halten, wenn es bewusstlos ist (siehe Abbildung 1L).
HINWEIS: Die Maus wird auf die Seite in den Bergungskäfig gelegt. Um Erstickungsgefahr zu vermeiden, setzen Sie das Tier in einen Auffangkäfig ohne Einstreu oder auf ein Taschentuch, wenn sich die Einstreu im Käfig befindet. - Setzen Sie den Kippschalter Extend/Retract Wieder auf die Position Center/Off zurück.
HINWEIS: Der Strom läuft weiter, wenn der Schalter entweder in der Ausfahr- oder in der Einfahrposition belassen wird, wodurch der Kolben anschwillt. Der Prallbrecher ist dann erst funktionsfähig, wenn der Kolben abgekühlt ist. - Nehmen Sie den Impaktor aus der Halterung und legen Sie ihn vorsichtig auf den Eisbeutel.
HINWEIS: Den Impaktor auf einem Eisbeutel zu halten, hilft, das mögliche Anschwellen des Impaktors zu reduzieren. - Überwachen Sie das Tier, bis der Aufrichtreflex auftritt und dokumentieren Sie die Zeit bis zum Aufrichten (siehe Abbildung 1M).
HINWEIS: Der Aufrichtreflex ist definiert als der Moment, in dem die Maus in eine Bauchlage zurückkehrt. Der Käfig muss ungestört bleiben; Die Maus kann sich korrigieren, wenn der Käfig berührt, bewegt oder Geräuschen ausgesetzt wird. - Bringen Sie die Mäuse in ihren Heimkäfig zurück, wenn sie wach und aufmerksam sind. In der Regel sind die Tiere innerhalb von 1 Stunde nach der Verletzung bei vollem Bewusstsein und können gehen. Geben Sie außerdem etwas feuchtes Futter auf den Boden des Käfigs.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Schritt 1: Einrichtung des Operationsbereichs. (A) Es wird ein Beispiel für den Operationsbereich und die Werkzeuge gezeigt, die für die Durchführung von CHI-Operationen erforderlich sind (Eisbeutel für den Impaktor, stereotaktischer Rahmen mit dem Impaktor, Impaktor-Steuerbox und chirurgische Instrumente). (B) Eine Nahaufnahme...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Etui mit 1.000 Clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope Software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific< | Surgery | |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047< | |
| Ear bars | Stoelting | 51649< | |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific< | Head Support apparatus | |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA< | |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induktionskammer | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isofluran, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Maus-Gasanästhesiekopf holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formal vertrieben von Lecia als impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown< | Post-surgery, keeping cage | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200< | |
| Povidon-Iod Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) verfügbares Jod, für Labor | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Salbe, Vaseline Augensalbe, steriles Augenschmiermittel | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Dako | Z0334< | ||
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-armiges Radialarm-Wasserlabyrinth | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101< | |
| Skalpellgriff #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alkohol-Vorbereitungspads (Isopropylalkohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750< | |
| SumnoSuite Low-Flow-Anästhesiesystem | Kent Scientific< | Surgery | |
| 10 mL Spritze Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Chirurgie |
| Topische Anästhesiecreme | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic salbe | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Vorbereitung auf Operationen |
