Analyse der Calciumdynamik und der Membranpotentialänderungen in einem arteriolären Endothel der Maus

Abstract

Quelle: Hakim, M. A. et al., Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Maus-Hirn-Parenchyms. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die funktionelle Analyse einer arteriolären Endothelröhre, die aus einem Mausgehirn isoliert wurde. Es werden die Schritte zur Messung des intrazellulären Kalziumspiegels und des Membranpotentials sowohl zu Studienbeginn als auch als Reaktion auf pharmakologische Stimulation beschrieben.

Protocol

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Tierschutzbehörde überprüft und genehmigt. Überprüfungsausschuss.

1. Materialien und Ausrüstung

HINWEIS: Siehe die Tabelle der Materialien für alle Reagenzien und Materialien, die für dieses Protokoll benötigt werden. Darüber hinaus können bei Bedarf auch Handbücher und Websites der jeweiligen Anbieter konsultiert werden.

1. Flow chamber
   1. Befestigen Sie eine Superfusionskammer mit einem Glasdeckglas auf einer Plattform aus eloxiertem Aluminium. Befestigen Sie die Plattform mit der Kammer auf einem Aluminium-Mikroskoptisch.
   2. Setzen Sie einen Mikromanipulator mit einer Pinting-Pipette an jedem Ende der Plattform auf den Aluminium-Mikroskoptisch.
      HINWEIS: Falls erforderlich, verwenden Sie eine übertragbare Tischvorrichtung mit einer Durchflusskammereinheit, um eine gesicherte, isolierte Endothelröhre zu Experimentierzwecken von einer Mikroskopvorrichtung zu einer anderen zu bewegen.
2. Microscopes
   1. Richten Sie die Versuchsapparatur ein, indem Sie ein inverses Mikroskop (Objektive: 4x, 10x, 20x, 40x und 60x) und einen manuellen Aluminiumtisch auf einem Schwingungsisolationstisch anbringen.
3. Intracellular V_m Aufnahmegerät
   1. Verbinden Sie das Elektrometer mit einer kompatiblen Kopfbühne. Verwenden Sie Zubehör, wie z. B. einen Funktionsgenerator und einen Stimulator, für Protokolle, die eine Strominjektion erfordern.
   2. Verbinden Sie die Verstärkerausgänge mit einem Datendigitalisierungssystem, einem Oszilloskop und akustischen Basismonitoren. Befestigen Sie die Referenzbadelektrode (Ag/AgCl-Pellet) in der Nähe des Ausganges der Strömungskammer.
   3. Stellen Sie ein photometrisches System mit integrierten Komponenten einer Fluoreszenzsystemschnittstelle, einer hochintensiven Bogenlampe und einem Netzteil, einem Hyperschalter, einer Photomultiplier-Röhre (oder PMT) und einer Kamera zusammen, um [Ca²⁺]_i in Endothelzellen.
   4. Montieren Sie einen Temperaturregler, der mit einer Inline-Heizung ausgestattet ist, um eine physiologische Temperatur (37 °C) während des gesamten Experiments zu erhöhen und aufrechtzuerhalten.
   5. Montieren Sie eine Mehrkanalplattform, die mit einer Ventilsteuerung mit einem Inline-Durchflussregelventil verbunden ist, um die Abgabe von Lösungen an Endothelröhrchen zu steuern, die in der Kammer gesichert sind.
4. Mikropipetten und scharfe Elektroden
   NOTE: Der Experimentator benötigt einen elektronischen Glasabzieher und eine Mikroschmiede, um das Anstecken vorzubereiten Pipetten.
   1. Um das Endothelrohr in der Superfusionskammer zu sichern, bereiten Sie heißpolierte Pinning-Pipetten mit einem abgestumpften, kugelförmigen Ende (Außendurchmesser: 50-70 μm) vor, die aus dünnwandigen Borosilikatglaskapillaren hergestellt wurden.
   2. Um den V_m einer Endothelzelle scharfe Elektroden mit einem Spitzenwiderstand von ~150 ± 30 MΩ aus Glaskapillaren nur mit dem Glasabzieher herstellen.

2. Lösungen und Medikamente

1. Physiologische Salzlösung (PSS)
   1. Bereiten Sie mindestens 1 L PSS mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl vor₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES) und 10 mM Glukose.
   2. Bereiten Sie die notwendigen Lösungen ohne CaCl₂ (null Ca²⁺ PSS) für die Dissektion von Hirnarteriolen und die Isolierung von Endothelen Rohre.
      HINWEIS: Alles vorbereiten Lösungen in ultrareiner deionisierter H₂O, gefolgt von der Filtration (0,22 μm). Stellen Sie sicher, dass das Endprodukt einen pH-Wert von 7,4 mit einer Osmolalität zwischen 290 und 300 mOsm enthält.
2. Fura-2 und pharmakologische Wirkstoffe
   1. Bereiten Sie Fura-2 AM Vorrat an Dimethylsulfoxid (DMSO; 1 mM) vor. Bereiten Sie 500 μl Arbeitskonzentration (10 μM) vor, indem Sie 5 μl des Stoffes zu 495 μl PSS zum Laden hinzufügen.
   2. Bereiten Sie mindestens 50 ml Arbeitskonzentrationen pharmakologischer Wirkstoffe in PSS oder DMSO vor.
3. Leitende Lösung
   1. Bereiten Sie 2 M KCl vor, indem Sie KCl in deionisiertem H₂O (7.455 g KCl in 50 mL H₂O). Geben Sie die Lösung durch eine Spritze mit einem 0,22 μm Filter, bevor Sie die scharfen Elektroden wieder füllen.

3. Verwendung von arteriolären Endothelröhren zur Untersuchung der Zellphysiologie

NOTE: Isolierte und gesicherte arterioläre Endothelröhren können für intrazelluläre Aufzeichnungen von [Ca²⁺]_i dynamics and V_m unter Verwendung von Photometrie bzw. Elektrophysiologie der scharfen Elektrode, wie zuvor dargestellt (Abbildung 1). [CA²⁺]_i und V_m können als separate oder kombinierte experimentelle Variablen gemessen werden (Figure 1). Arterioläre Endotheltuben sind jedoch empfindlicher als arterielles Endothel, und die Experimentierzeit sollte 1 h nicht überschreiten.

1. Messung von [Ca²⁺]_i
   1. Schalten Sie die Ausrüstung und Software für [Ca²⁺]_i Aufnahmen bei kontinuierlicher Superfusion mit einer Flussrate von 5-7 mL/ Min.
   2. Laden Sie die Endothelröhre mit dem Ca²⁺ Fura-2 AM 30 min bei Raumtemperatur färben. Waschen Sie die Zellen weitere 20-30 Minuten lang mit Superfusionslösung, während Sie die Badtemperatur allmählich auf 37 °C erhöhen. Halten Sie die Temperatur während des gesamten Experiments bei 37 °C.
   3. Passen Sie das Bildfenster manuell mit der Photometrie-Software an, um auf ~20 Endothelzellen zu fokussieren (Figure 1A). Wenn kein Licht vorhanden ist, schalten Sie das PMT auf die Fluoreszenzschnittstelle ein und beginnen Sie mit der Erfassung von [Ca²⁺]_i indem Fura-2 abwechselnd (≥10 Hz) bei 340 nm und 380 nm angeregt wird, während die Fluoreszenzemission bei 510 nm gesammelt wird. Einmal eine stabile Baseline-Aufzeichnung von [Ca²⁺]_i etabliert ist, wenden Sie pharmakologische Wirkstoffe (z. B. purinerge Rezeptoren Agonisten) gemäß dem experimentellen Ziel (Figure 1B).
2. Messung von V_m
   1. Schalten Sie die Ausrüstung und Software für V_m Aufzeichnungen und stellen Sie die Datenerfassungsrate (≥10 Hz) ein, während eine kontinuierliche Superfusion bei einer Flussrate von 5-7 mL/min aufrechterhalten wird. Erhöhen Sie die Badtemperatur allmählich auf 37 °C und halten Sie sie bis zum Ende des Versuchs.
   2. Ziehen Sie eine scharfe Elektrode mit einer Kapillare aus Borosilikatglas heraus, verfüllen Sie sie mit 2 M KCl und befestigen Sie sie über einem mit Chlorid beschichteten Silberdraht in dem Pipettenhalter, der an einem Elektrometer befestigt ist, das wiederum von einem Mikromanipulator gehalten wird.
   3. Während Sie durch das 4x-Objektiv schauen, positionieren Sie mit einem Mikromanipulator die scharfe Elektrodenspitze vorsichtig knapp über einer Zelle des arteriolären Endothelrohrs in das fließende PSS in der Kammer.
   4. Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 400-fache und positionieren Sie die Elektrodenspitze nach Bedarf neu.
   5. Führen Sie mit dem Mikromanipulator vorsichtig die Spitze einer scharfen Elektrode in eine der Zellen der Endothelröhre ein und beginnen Sie mit der Aufnahme V_m mit einem Elektrometer (Figure 1A).

Einmal das endotheliale ruhende V_m stabil ist (-30 bis -40 mV), wenden Sie die gewünschte pharmakologische Agenten pro Versuchsziel (Figure 1C).

Results

Abbildung 1: Anwendung einer Endothelröhre zur physiologischen Untersuchung von Signalwegen, die mit der Regulation des Blutflusses zusammenhängen. (A) Eine scharfe Elektrode (violetter Pfeil) befindet sich in einer Zelle einer Endothelröhre, die im Datenerfassungsfenster für die Photometrie fokussiert ist. (B) Repräsentative Aufzeichnung von intrazellulärem Ca^2+<...

Materials