Beurteilung der exzitatorischen Neurotransmitterspiegel bei chronischen Epilepsie-induzierten Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Soukupová, M., et al. Mikrodialyse von exzitatorischen Aminosäuren während EEG-Aufzeichnungen bei frei beweglichen Ratten. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Beurteilung der extrazellulären exzitatorischen Neurotransmitterspiegel bei Ratten mit chronischer Epilepsie-Induktion. Nach der Implantation einer Mikrodialysesonde in das Gehirn und der Bestätigung des Fehlens von Anfällen mittels Elektroenzephalographie (EEG) wird extrazelluläre Flüssigkeit gesammelt, um erhöhte Neurotransmitterspiegel bei epileptischen Ratten zu bewerten. Eine kaliumreiche Lösung wird dann infundiert, um die neuronale Erregbarkeit aufrechtzuerhalten und eine erhöhte Freisetzung von Neurotransmittern auszulösen, wobei Proben entnommen werden, um den kaliuminduzierten Peak der exzitatorischen Neurotransmitter zu beurteilen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

Dieses Protokoll ist speziell für die Bestimmung von Glutamat und Aspartat in Dialysaten des Gehirns von Ratten abgestimmt, die unter EEG-Kontrolle von Mikrodialysesitzungen bei epileptischen und nicht-epileptischen Ratten gewonnen wurden. Viele der hier beschriebenen Materialien lassen sich leicht durch solche ersetzen, die man in seinem Labor für EEG-Aufzeichnungen oder Mikrodialyse verwendet.

1. Montage des Mikrodialyse-Sonden-Elektroden-Geräts

:

1. Verwenden Sie eine 3-Kanal-Zwei-Schuss-Elektrode (mit mindestens 20 mm Schnittlänge der Registrierungselektrode und einer 10 cm langen Erdungselektrode) und koppeln Sie diese an eine Führungskanüle, um das Gerät vorzubereiten. Beispiele für 3-Kanal-Elektroden und Führungskanülen für die Dialyse finden Sie in Abbildung 1A-1B.
2. Entfernen (Abbildung 1C) und führen Sie die Führungskanüle aus Metall vor der Verwendung einige Male in die Dummy-Kunststoffkanüle ein, um die Entnahme im Moment des Wechsels für die Mikrodialysesonde bei Tieren zu erleichtern.
3. Biegen Sie die verdrillten Drähte der Registrierungselektrode zweimal (Abbildung 1E-1F), um die Drähte mit der Dummy-Kanüle der Führung auszurichten, und schneiden Sie die Elektrodenspitze (Abbildung 1G) mit dem digitalen Messschieber so ab, dass sie 0,5 mm länger ist als die Spitze der Führungskanüle (Abbildung 1H).
4. Halten Sie den 1 mm langen Silikonring (AD 2 mm, Dicke 0,3 mm; Abbildung 1I) bereit und führen Sie die Spitze der Führungskanüle und die Spitze der gedrehten Elektroden mit der Pinzette in den Silikonring ein (Abbildung 1J). Befestigen Sie es am Fuß des Führungskanülensockels mit Polymerkleber mit schneller Wirkung oder Harz (Abbildung 1K). Siehe das Beispiel der fertigen Geräte in Abbildung 1L und Abbildung 2A.
5. Sterilisieren Sie das Gerät 4 h lang unter keimtötendem UV-Licht. Drehen Sie das Gerät viermal um, so dass jede seiner Seiten 1 h lang dem Licht ausgesetzt ist.
   Hinweis: Viele selbstgebaute Elektroden und Mikrodialysesonden können auf ähnliche Weise montiert werden. Der Kopf des oben beschriebenen Implantats für Ratten hat folgende Abmessungen: 7 mm Breite x 5 mm Tiefe x 10 mm Länge von der Spitze bis zur Sockelspitze; Die Implantatspitze ist ca. 11 mm lang, hat einen Durchmesser von 600 μm und das gesamte Gerät wiegt etwa 330-360 mg. Das Gerät kann zwei- oder dreimal wiederverwendet werden, wenn (i) während der Operation eine ausreichende Länge der Masseelektrode auf dem Schädel für die nächste Verwendung verbleibt und (ii) wenn das Tier getötet und das Gerät zusammen mit dem Zahnzement geborgen wird, es über Nacht in Aceton belassen wird, so dass der Zement mechanisch disaggregiert werden kann, und das Gerät wieder gewaschen und sterilisiert.

2. Stereotaktische Chirurgie

1. Verwenden Sie für die Geräteimplantation ein stereotaktisches Gerät und einen Sondencliphalter (Abbildung 2B) nach den heutigen Standards für aseptische und schmerzfreie Operationen.
   1. Betäuben Sie die erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Ketamin/Xylazin-Gemisch (43 mg/kg und 7 mg/kg, i.p.) und fixieren Sie es auf dem stereotaktischen Rahmen. Fügen Sie der anfänglichen Ketamin/Xylazin-Injektion eine Isofluran-Anästhesie (1,4% in Luft; 1,2 ml/min) hinzu, da dies ermöglicht, die Narkosetiefe rechtzeitig zu kontrollieren. Rasieren Sie das Fell auf dem Kopf des Tieres.
2. Tupfen Sie die Oberfläche der Kopfhaut mit einer Lösung auf Jodbasis und anschließend mit 70 % Ethanol ab, um sie für die aseptische Operation vorzubereiten.
   1. Implantieren Sie das in der Reihenfolge (1.1 – 1.5) vorbereitete Führungskanülen-Elektrodengerät in den rechten ventralen Hippocampus mit den folgenden Koordinaten: Nasenstange + 5.0 mm, A – 3.4 mm, L + 4.5 mm, P + 6.5 mm zum Bregma. Befolgen Sie die Standardtechniken für stereotaktische Operationen.
   2. Achten Sie darauf, dass die Verankerungsschrauben nicht verdeckt werden. Wenn Sie es an der stereotaktischen Apparatur montieren, fassen Sie die Vorrichtung für den Führungskanülenkopf, da diese leicht auf den Sondenhalter ausgerichtet werden kann.
3. Verankern Sie das Gerät mit mindestens vier Edelstahlschrauben am Schädel und schrauben Sie diese in den Schädelknochen (1 Schraube in die linke und 1 Schraube in die rechte Stirnbeinplatte, 1 Schraube in die linke Scheitelplatte und 1 Schraube in die interparietalen Knochenplatten). Füge einen Tropfen Gewebekleber hinzu, um jede Schraube weiter am Schädelknochen zu befestigen.
   1. Bedecken Sie die Hälfte der Schraubengewinde mit Methacrylzement. Fördern Sie die Bindung des Zementes, indem Sie flache Rillen in den Knochen bohren, um die Haftung zu erhöhen.
4. Sobald die Spitze des Geräts im Hirngewebe positioniert ist, drehen Sie den Draht der Erdungselektrode um 3 Verankerungsschrauben. Decken Sie alle montierten Schrauben und das Gerät mit dem Zahnzement ab.
5. Überwachen Sie die Tiere während der Operation und danach etwa 1 Stunde lang, bis sie sich aufrichten und sich im Käfig bewegen. Bewahren Sie sie auf einem Wärmekissen auf, um Unterkühlung zu vermeiden. Lassen Sie die Ratten sich mindestens 7 Tage nach der Implantation des Geräts erholen.
6. Überwachen Sie die Tiere mindestens einmal täglich für 3 Tage nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden. Geben Sie den Tieren 3 Tage lang die antibiotische Creme (Gentamycin 0,1%) in der Nähe der Einschnittstelle, um die Infektion zu verhindern, und ein Analgetikum (Tramadol 5 mg/kg, intraperitoneal [i.p.]), um die postoperativen Schmerzen zu verhindern.

3. Induktion der Temporallappen-Epilepsie durch Pilocarpin und Zuordnung der Tiere zu Versuchsgruppen

1. Nach einer Woche postoperativer Genesung werden die Tiere nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt: (i) Kontrolltiere, die ein Vehikel erhalten, und (ii) epileptische Tiere, die Pilocarpin erhalten. Verwenden Sie eine proportional höhere Anzahl von Tieren für die epileptische Gruppe, da nicht alle Ratten, denen Pilocarpin verabreicht wird, die Krankheit entwickeln.
2. Injizieren Sie eine Dosis Methylscopolamin (1 mg/kg, subkutan [s.c.]) und 30 Minuten danach eine einmalige Injektion von Pilocarpin (350 mg/kg, i.p.), um den Status epilepticus (SE) zu induzieren. Injizieren Sie Methylscopolamin und das Vehikel (Kochsalzlösung) in die Kontrollratten. Verwenden Sie 1 ml-Spritze mit 25-G-Nadel für alle i.p. Verabreichungen.
   1. Überprüfen Sie visuell die Tiere, um Verhaltensanfälle zu bekommen (Vibrissa innerhalb von 5 Minuten bewegen, Kopf nicken, die Gliedmaßen klonen) und innerhalb von 25 Minuten, um kontinuierlich den gesamten Körper (SE) zu klonen.
3. Arrest der SE 2 Stunden nach dem Beginn, um eine Mortalität von etwa 25 % und eine mittlere Latenzzeit von etwa 10 Tagen durch Verabreichung von Diazepam (20 mg/kg, i.p.) zu erreichen. Beobachten und notieren Sie jedes Anfallsverhalten, das unmittelbar nach der Pilocarpin-Injektion beginnt und danach mindestens 6 Stunden lang anhält.
4. Geben Sie den Tieren Kochsalzlösung (1 ml, i.p.) mit 1 ml Spritze mit 25 g Nadel und Saccharoselösung (1 ml, per os [p.o.]) mit 1 ml Spritze und flexibler Fütterung 17 g Nadel für 2-3 Tage nach SE, um die Wiederherstellung des Körpergewichtsverlusts zu fördern.
   1. Schließen Sie die Tiere, die das anfängliche Körpergewicht nicht innerhalb der ersten Woche nach der Pilocarpin SE erreichen, aus der Studie aus (mit Ausnahme der akuten Gruppe, die 24 Stunden nach SE getötet wurde, wo die Nachverfolgung des Körpergewichts nicht möglich ist).
5. Ordnen Sie Post-SE-Tiere nach dem Zufallsprinzip verschiedenen Versuchsgruppen zu (Abbildung 3): akute Phase (in der die Mikrodialyse 24 h nach SE stattfindet), Latenzzeit (7-9 Tage nach SE), erster spontaner Anfall (ca. 11 Tage nach SE) und chronische Periode (beginnt etwa 22-24 Tage nach SE, d.h. etwa 10 Tage nach dem ersten Anfall). Überwachen Sie die Tiere auf das Auftreten von spontanen Anfällen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden Einschluss-/Ausschlusskriterien für weitere Versuche an epileptischen Ratten: Entwicklung eines konvulsiven SE innerhalb von 1 h nach Verabreichung von Pilocarpin; Gewichtszunahme in der ersten Woche nach SE und die korrekte Positionierung der Mikrodialysesonde und der Elektrode.

4. Überwachung und Analyse des epileptischen Verhaltens

1. Langzeitüberwachung des epileptischen Verhaltens
   1. Etwa 6 Stunden nach der Verabreichung von Pilocarpin (d.h. am Ende der direkten Beobachtung durch die Forscher), setzen Sie die Tiere in die sauberen Heimkäfige und starten Sie die 24-stündige Videoüberwachung.
   2. Setzen Sie die 24-Stunden-Videoüberwachung bis zum 5. Tag mit einem digitalen Videoüberwachungssystem fort.
   3. Ab Tag 5 verbinden Sie die Ratten in ihren rechteckigen Käfigen zu Hause mit dem angebundenen EEG-Aufzeichnungssystem und setzen die 24-Stunden-Videoüberwachung fort.
   4. Stellen Sie die Parameter an dem Verstärker ein, der außerhalb des Faradayschen Käfigs positioniert ist (stellen Sie den Verstärkungsfaktor auf jedem Kanal entsprechend der Spezifität des EEG-Signals jedes einzelnen Tieres ein) und starten Sie die EEG-Erfassung, indem Sie das EEG-Signal beobachten, das von nicht angeschlossenen Kabeln erzeugt wird. Verwenden Sie eine Abtastrate von 200 Hz und einen Tiefpassfilter, der auf 0,5 Hz eingestellt ist.
   5. Verbinden Sie das Tier mit Kabeln, die den Kopf eines Tieres zwischen zwei ausgestreckten Fingern einer Hand halten und schrauben Sie die Stecker mit der anderen freien Hand an den Elektrodensockel fest. Starten Sie die Erfassung.
      VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass das Signal frei von Artefakten ist. Häufige Artefakte sind die Stacheln, die den Maßstab weit überschreiten.
   6. Einen Tag vor dem Mikrodialyse-Experiment überführen Sie die Tiere in das angebundene EEG-System, das mit Plexiglaszylindern für die Mikrodialyse ausgestattet ist. Trennen Sie die Tiere vom EEG-Anbindesystem im Heimkäfig, indem Sie die Stecker von der Elektrode verschrauben, ohne das Tier zurückzuhalten. Setze das Tier in die hohen Plexiglaszylinder.
2. Überwachung des epileptischen Verhaltens einen Tag vor und während der Mikrodialysesitzung
   1. Schalten Sie den Verstärker ein, der außerhalb des Faradayschen Käfigs positioniert ist. Öffnen Sie die EEG-Software. Starten Sie die EEG-Erfassung, indem Sie das EEG-Signal beobachten, das von nicht angeschlossenen Kabeln erzeugt wird.
   2. Verbinden Sie das Tier mit dem angebundenen EEG-Aufzeichnungssystem, indem Sie den Kopf des Tieres zwischen zwei ausgestreckten Fingern einer Hand halten und mit der anderen freien Hand die Stecker mit dem Elektrodensockel festschrauben. Stellen Sie auf jedem Kanal des Verstärkers einen Verstärkungsfaktor (Verstärkung) entsprechend dem Elektrodensignal des einzelnen Tieres ein, so dass das EEG-Signal im Maßstab liegt. Lassen Sie das Tier den neuen Käfig (Zylinder) mindestens 1 h unter direkter Beobachtung des Forschers erkunden.
   3. HINWEIS: 24 h vor dem Mikrodialyse-Experiment werden die Ratten kurz mit Isofluran betäubt, um die Führungskanülen auf die Mikrodialysesonde umzustellen. Nutzen Sie den Moment, in dem sie narkotisiert werden, um sie an das EEG-Aufzeichnungssystem anzuschließen.
   4. Kürzen oder verlängern Sie das pendelnde Kabel je nach tierischer Ware. Achten Sie darauf, dass die Kabel die Bewegungen und die Liegehaltung des Tieres nicht beeinträchtigen.
   5. Überprüfen Sie, ob die Videokameras den richtigen Bildausschnitt haben. Starten Sie die Video-EEG-Aufzeichnung.
3. Identifizierung von Anfällen und EEG-Aktivität
   1. Verwenden Sie einen Software-Player, um die Videos anzusehen. Scrollen Sie den Film 8-mal schneller als in Echtzeit und individualisieren Sie die generalisierten Anfälle (siehe Tieraufzucht mit Vordergliedmaßen-Klonus oder Tieraufzucht und -fallen mit Vordergliedmaßen-Klonus). Verlangsamen Sie das Video und notieren Sie sich den genauen Zeitpunkt des Beginns und des Endes des Verhaltensanfalls.
   2. Verarbeiten Sie die Daten, indem Sie die Anzahl der generalisierten Anfälle zählen, die in 24 Stunden von Videoaufzeichnungen beobachtet wurden, und drücken Sie sie in Bezug auf die Anfallshäufigkeit und -dauer als Mittelwerte aller in 24 Stunden beobachteten Anfälle aus.
   3. Definieren Sie die EEG-Anfälle als die Perioden paroxysmaler Aktivität mit hoher Frequenz (>5 Hz), die durch ein >3-faches Amplitudeninkrement gegenüber dem Ausgangswert gekennzeichnet sind, mit einer Progression der Spike-Frequenz, die mindestens 3 s oder ähnlich anhält. Verwenden Sie eine EEG-Software, um die EEG-Rohaufzeichnungen zu verarbeiten. Teilen Sie die EEG-Kurven in 1-Stunden-Fraktionen auf. Kopieren Sie die EEG-Bruchteile in eine Datei für die automatische Spike-Analyse der Software.
   4. Analyse der EEG-Aktivitätsdaten mit EEG-Software und vordefinierten Parametern (4.3.3.). Führen Sie alle Videoanalysen mit zwei unabhängigen Untersuchern durch, die für die Gruppe der analysierten Tiere blind sind. Im Falle einer Abweichung sollten sie die Daten gemeinsam erneut überprüfen, um einen Konsens zu erzielen.

5.

1. Bergung der Mikrodialyse-In-vitro-Sonde
   1. Bereiten Sie die Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers für den ersten Gebrauch vor und handhaben Sie sie in ihrer Schutzhülle.
   2. Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung durch: Bereiten Sie drei 1,5-ml-Reagenzgläser vor und beladen Sie sie mit 1 ml Ringer-Lösung, die die Mischung der Standards (2,5 μM Glutamat und 2,5 μM Aspartat) enthält. Setzen Sie drei geladene 1,5-ml-Reagenzgläser in die auf 37 °C eingestellte Blockheizung ein und positionieren Sie sie auf dem Rührer.
      HINWEIS: Verwenden Sie die gleichen Standardlösungen für Chromatographie-Kalibrierungen.
   3. Verschließen Sie die 1,5 mL Reagenzgläser mit Paraffinfilm und stechen Sie sie mit einer scharfen Pinzette ein, um ein Loch von ca. 1 mm Durchmesser zu machen.
   4. Nehmen Sie die Sonde und führen Sie sie in das Loch in der Paraffinfolie ein. Tauchen Sie die Membran mindestens 2 mm unter die Lösungsebene. Befestigen Sie die Sonde weiter mit einer Paraffinfolie am 1,5-ml-Reagenzglas.
      ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht die Wände des 1,5-ml-Reagenzglases berührt.
   5. Verbinden Sie den Sondeneinlass mit Hilfe von Schläuchen und Schlauchadaptern aus fluoriertem Ethylenpropylen (FEP) mit der an der Infusionspumpe montierten Spritze. Verwenden Sie optional Polyethylenschläuche mit feiner Bohrung mit einem Innendurchmesser (ID) von 0,28 mm und einem Außendurchmesser von 0,61 mm (AD) sowie farbige Schlauchadapter (rote und blaue Schlauchadapter) für die Verbindungen.
   6. Starten Sie die Pumpe bei 2 μL/min und lassen Sie die Flüssigkeit an der Auslassspitze austreten. Verbinden Sie den Sondenausgang mit dem 0,2-ml-Sammelreagenzglas mit FEP-Schläuchen und Schlauchadaptern.
      HINWEIS: Verwenden Sie für alle Anschlüsse FEP-Schläuche. Schneiden Sie den Schlauch mit einer Rasierklinge auf die gewünschte Länge. Verwenden Sie Schlauchadapter in verschiedenen Farben für den Einlass und Auslass der Sonde. Lassen Sie die Pumpe 60 min laufen. Auf Undichtigkeiten und Luftblasen prüfen. Diese sollten nicht vorhanden sein.
   7. Stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von 2 μL/min ein und beginnen Sie mit der Entnahme der Proben auf der Auslassseite des Schlauchs.
   8. Sammeln Sie drei 30-minütige Perfusatproben und drei Proben mit gleichem Volumen der Lösung im 1,5-ml-Reagenzglas. Entnehmen Sie alle 30 Minuten die gleichen Volumina aus dem 1,5-ml-Reagenzglas mit der Mikrospritze, die in die Standardlösung im 1,5-ml-Reagenzglas getaucht ist.
   9. Wiederholen Sie das Experiment (5.1.1-5.1.8) und stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von 3 μl/min (5.1.7) ein, um einen Vergleich der Sondenrückgewinnung bei Verwendung von zwei verschiedenen Perfusionsflussraten zu erhalten.
   10. Wenn Sie fertig sind, stoppen Sie die Pumpe und spülen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser und 70 % Ethanol aus und drücken Sie die Luft hinein. Bewahren Sie die Sonde in einem Fläschchen auf, das mit sauberem destilliertem Wasser gefüllt ist. Spülen Sie die Sonde gründlich, indem Sie sie vor der Lagerung bei 2 μl/min mit destilliertem Wasser perfundieren.
   11. Analysieren Sie die Konzentration von Glutamat und Aspartat in den Proben durch Chromatographie.
   12. Berechnen Sie die Wiederfindung anhand der folgenden Gleichung:
       Wiederfindung (%) = (_C-Perfusat /_{C-dialysierte Lösung}) x 100.
2. Mikrodialysesitzungen bei frei beweglichen Ratten
   1. Präparative Verfahren: Sondeneinführen und -testen, Einstellung und Start der Infusionspumpe
      1. Bereiten Sie die Mikrodialysesonden für den ersten Gebrauch gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers vor und füllen Sie sie mit Ringer's Lösung. Schneiden Sie ca. 10 cm lange Stücke FEP-Schläuche ab und verbinden Sie diese mit den verschiedenfarbigen Schlauchadaptern mit den Ein- und Auslaufkanülen der Sonde.
      2. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter berührt und keine Toträume in allen Anschlüssen vorhanden sind.
      3. 24 h vor dem Mikrodialyse-Experiment das Tier in einer Induktionskammer kurz mit Isofluran (5% an Luft) betäuben, bis es liegt. Nehmen Sie die Schnullerkanüle mit der Pinzette aus der Führung und halten Sie den Kopf des Tieres fest. Führen Sie die Mikrodialysesonde, die mit einer Dialysierungsmembran ausgestattet ist, in die Führungskanüle ein und fixieren Sie die in ihre Führung eingeführten Mikrodialysekanülen weiter mit Modelliermasse.
         ACHTUNG: Lassen Sie die Sonde beim Herausziehen nicht die Wände der Schutzsondenhülse berühren.
      4. Setzen Sie das Tier in den Plexiglaszylinder ein und lassen Sie es das neue Ambiente erkunden. Schließen Sie das Tier wie oben beschrieben an das angebundene EEG-Aufzeichnungssystem an (befolgen Sie die Punkte 4.2.2 und 4.2.3).
      5. Folgen Sie den wachen und sich frei bewegenden Bewegungen der Ratte und verbinden Sie den Einlass der Sonde mit den Schlauchadaptern mit der 2,5-ml-Spritze mit der abgestumpften 22G-Nadel mit der Ringer-Lösung. Drücken Sie die Ringer-Lösung in die Sonde und stoßen Sie 1 ml der Ringer-Lösung in 10 s aus, indem Sie den Kolben der 2,5-ml-Spritze kontinuierlich drücken. Prüfen Sie, ob die Flüssigkeit auf den Auslass tropft. Die Sonde ist nun einsatzbereit.
      6. Füllen Sie die 2,5-ml-Spritzen, die mit den FEP-Schläuchen über Schlauchadapter verbunden sind, mit Ringer-Lösung auf und montieren Sie sie auf die Infusionspumpe. Starten Sie die Pumpe bei 2 μL/min. Lassen Sie es über Nacht laufen.
         HINWEIS: Verwenden Sie die gewünschte Länge aller FEP-Schläuche, berechnen Sie jedoch das Totvolumen der Schläuche, um zu wissen, wann die hohe K⁺-Stimulation gestartet werden sollte und um die Quantifizierungsdaten mit neurochemischen Veränderungen im Tiergehirn zu korrelieren. Verwenden Sie die Luftblase, die in den Schläuchen unter dem Arbeitsstrom entsteht, um diese Zeit zu berechnen.
   2. Entnahme von Proben während der EEG-Aufzeichnung und Kaliumstimulation
      1. Überprüfen Sie, ob in den 3 Stunden vor Beginn der Probenentnahme keine Anfälle aufgetreten sind (Video-EEG-Aufzeichnungen) und überwachen Sie weiterhin die Anfallsaktivität während der Mikrodialyse.
      2. Stoppen Sie die Pumpe mit den FEP-Schläuchen, kanülierten Spritzen, die mit Ringer-Lösung gefüllt sind. Montieren Sie auf der Pumpe einen weiteren Satz 2,5-ml-Spritzen, die mit FEP-Schläuchen verbunden sind, mit Schlauchadaptern, die mit einer modifizierten Ringer-Lösung gefüllt sind, die 100 mM K⁺ Lösung enthält.
      3. Starten Sie die Pumpe bei 2 μL/min und lassen Sie sie laufen. Für ein schnelleres Befüllen des Schlauchs stellen Sie die Pumpe für die Zeit der Befüllung auf 5 μL/min ein. Prüfen Sie, ob sich keine Luftblasen im System befinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter berührt und keine Toträume in allen Anschlüssen vorhanden sind.
      4. Die Sonde ist auf gebrauchsfertige Verwendung bei Tieren wie oben beschrieben (5.2.1.5) zu prüfen.
      5. HINWEIS: Wenn die Sonde aus irgendeinem Grund nicht funktioniert, wechseln Sie sie. Halten Sie für diese Fälle einige vorbereitete Mikrodialysesonden in der Nähe des Mikrodialyse-EEG-Arbeitsplatzes bereit. Trennen Sie das Tier von EEG-Kabeln und betäuben Sie es bei Bedarf kurz mit Isofluran, um die Veränderung zu realisieren.
      6. Verbinden Sie den FEP-Schlauch von Spritzen, die mit Ringer-Lösung gefüllt sind, mit der Einlasskanüle der Sonde bei jedem Tier und warten Sie, bis der Flüssigkeitstropfen an der Spitze des Auslasses erscheint.
      7. Verbinden Sie den Ausgang der Sonde mit dem FEP-Schlauch, was zur Sammlung im Reagenzglas führt. Führen Sie den FEP-Schlauch in das geschlossene 0,2 mL Reagenzglas mit einer perforierten Kappe ein. Stellen Sie sicher, dass das Rohr an Ort und Stelle bleibt, indem Sie es mit einem Stück Modelliermasse fixieren.
      8. Lassen Sie die Pumpe 60 Minuten lang mit 2 μl/min laufen, ohne Proben zu entnehmen, um das System auszugleichen (Nullprobe).
      9. Entnahme von 5 aufeinanderfolgenden 30-minütigen Dialysatproben (60 μl jeweiliges Volumen) unter Ausgangsbedingungen (Perfusion mit normaler Ringer-Lösung). Lagern Sie die Proben auf Eis.
      10. Berechnen Sie die Zeit, die Flüssigkeit benötigt, um von der Pumpe in den Kopf des Tieres zu gelangen (sie hängt vom Totvolumen des Schlauchs ab, d.h. von der Luftblasenzeit) und schalten Sie den FEP-Schlauch um, der zu diesem Zeitpunkt von den Spritzen mit normaler Ringer-Lösung zu Spritzen mit modifizierter (100 mM K⁺) Ringer-Lösung geht, ohne die Pumpe anzuhalten. Prüfen Sie, ob sich keine Luftblasen im System befinden. Lassen Sie die Pumpe 10 Minuten lang laufen. ACHTUNG: In 10 Minuten hoher K⁺-Stimulation neigen die Tiere dazu, sich frenetisch zu bewegen und zeigen in der Regel eine große Anzahl von nassen Hundeschütteln (Kontroll- und außerhalb von Anfallsclustertieren) oder Verhaltensanfälle (epileptische Tiere), seien Sie also bereit einzugreifen, um die Schläuche und Kabel vor Verdrehen zu schützen.
      11. Wechseln Sie nach 10 Minuten den Schlauch von den Spritzen mit 100 mM K⁺ Ringer-Lösung auf normale Ringer-Lösung und lassen Sie die Pumpe laufen. Schalten Sie die Pumpe während des Lösungswechsels nicht aus, so dass sich am Ende des Schlauchs, der in Linie angeschlossen werden soll, ein Tropfen der Flüssigkeit befindet.
      12. Ab dem Zeitpunkt, an dem das Dialysat einen hohen Kaliumgehalt enthält, d.h. nach der Entnahme des fünften Dialysats nach dem Gleichgewicht, entnehmen Sie die Dialysatfraktionen alle 10 min (20 μL) für 1 h. Entnehmen Sie 3 weitere 30 min Dialysatproben und stoppen Sie die Pumpe. Lagern Sie die Proben auf Eis.
      13. Lagern Sie die Proben nach dem Experiment bei -80 °C bis zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse.
      14. Wiederholen Sie das Mikrodialyse-Experiment an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, mit Ausnahme der akuten (24 h) und der ersten Anfallsgruppe, in der nur eine Mikrodialysesitzung 24 h nach SE oder innerhalb von 24 h nach dem ersten spontanen Anfall stattfindet (Abbildung 3).

Ergebnisse

Abbildung 1. Schritt-für-Schritt-Vorbereitung des zu implantierenden Geräts. (A) 3-Kanal-Elektrode mit 10 cm langer Erdungselektrode in der Schutzhülle auf der linken Seite und Führungskanüle für die Mikrodialyse auf der rechten Seite, die zum Zusamm...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Kanal zweifach gedrehte Elektrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
Führungskanüle	Agn Tho's, Lindigö, Schweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgen-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Lösung
Xylazine	Sigma, Mailand, Italien	X1251	Material
Isofluran-Vet	Merial, Toulouse, Frankreich	103120022 (AIC)	Lösung
Altadol 50 mg/ ml - Tramadol	Formevet, Mailand, Italien	103703017 (AIC)	Lösung
Gentalyn 0.1% crm - Gentamycin	MSD Italia, Roma, Italien	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental	cement Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Vereinigtes Königreich	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement Shofu	, Kyoto, Japan	PN1167	Material
Sondencliphalter	Agn Tho's, Lindigö, Schweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml - Diazepam	Roche, Monza, Italien	019995063 (AIC)	Material
1 mL Spritze mit 25G Nadel	Vetrotecnica, Padova, Italien	3	Material
Ratte flexible Fütterungsnadel 17G	Agn Tho's, Lindigö Schweden	7206	Material
Grass Technology apparat	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 Verstärker, Stoffauflauf, Verbindungskabel, Telefaktor-Modell RPSA S40)
modulares Datenerfassungs- und Analysesystem MP150	Biopac, Goleta, Kalifornien, USA	MP150WSW	Ausrüstung
digitales Videoüberwachungssystem	AverMedia Technologies, Fremont, Kalifornien, USA	V4.7.0041FD	Equipment
Mikrodialysesonde	Agn Tho's, Lindigö Schweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
Mikrodialysesonde	Synaptech, Colorado Federn, Colorado, USA	S-8010	Material
Blockheizung	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
Rührer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italien	711	Equipment
Infusionspumpe	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
Polyethylenschlauch mit feiner Bohrung	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing	adapters Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL Spritze mit 22G Nadel	Chemil, Padova, Italien	S02G22	Material
Fläschchenkappe	Cronus, Labicom, Olomouc, Tschechische Republik	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL	Septum Material
Glaseinsatz mit unterer Feder	Supelco, Sigma, Milano, Italien	27400-U	Material
Autosampler-Fläschchen	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italien	C4013-2	Material
Smartline Manager 5000 Systemsteuerung und Entgasungseinheit	Knauer, Berlin, Deutschland	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternäre Gradientenpumpe	Knauer, Berlin, Deutschland	V7603	Equipment
Ringer-Lösungszusammensetzung	in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA-Lösung
modifizierte Ringer-Lösungszusammensetzung	in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA-Lösung
Kochsalzlösung	0.9% NaCl, ph angepasst auf 7.0		Lösung
Saccharoselösung	10% Saccharose in destilliertem Wasser		Lösung

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