Immunmarkierung von neuronalen Membranproteinen in einer gefriergebrochenen Probe von Hirngewebe der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Schönherr, S., et. al. Kombinierte optogenetische und Gefrierfraktur-Replikat-Immunmarkierung zur Untersuchung der inputspezifischen Anordnung von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. J. Vis. exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Immunmarkierung von gefrierfrakturierten Nachbildungen von Hirngewebe von Mäusen für die Elektronenmikroskopie. Die gebrochenen und beschichteten Repliken werden verdaut, um Rezeptoren freizulegen. Primäre und goldmarkierte Sekundärantikörper werden hinzugefügt, um spezifische neuronale Membranrezeptoren zu markieren. Der Nachbau wird auf ein Gitter montiert und unter einem Elektronenmikroskop visualisiert.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung der Proben

1. Gehirnfixierung
   1. Zubereitung des Fixiermittels
      1. Für 1 l Fixiermittel 10 g Paraformaldehyd abwiegen und zu 300 ml deionisiertem Wasser (H₂O) geben. Unter ständigem Rühren ~10 min auf 55 - 60 ºC erhitzen.
      2. Schalten Sie die Hitze aus und fügen Sie 7 - 8 Tropfen 4 N Natriumhydroxid (NaOH) hinzu. Die Lösung sollte in ~10 Minuten klar sein.
      3. Lassen Sie es auf Raumtemperatur oder RT abkühlen, fügen Sie 150 ml einer gesättigten Lösung von Pikrinsäure hinzu und bringen Sie es auf 500 ml mit deionisiertem H₂O.
      4. 500 ml 0,2 M Phosphatpuffer (PB) zugeben. Filtern Sie mit Filterpapier. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein.
      5. Kühlen Sie das Fixiermittel auf 6 °C ab und lagern Sie es in dunklen Glasflaschen nicht länger als einen Tag bei 6 °C.
   2. Transkardiale Perfusion
      1. Betäuben Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Thiopental (120 mg/kg Körpergewicht). Stellen Sie sicher, dass das Tier tief betäubt ist, indem Sie den Pedalrückzugsreflex überprüfen, der nicht vorhanden sein sollte. Lege das Tier auf den Rücken auf einen Perfusionstisch, wobei die vier Enden festgebunden sind.
      2. Öffnen Sie die Bauchdecke in Längsrichtung mit einer stumpfen Schere und machen Sie zwei zusätzliche Schnitte seitlich entlang des kaudalen Randes des Brustkorbs, um das Zwerchfell freizulegen. Schneiden Sie das Zwerchfell ab und schneiden Sie die Brustwand an der osteoknorpeligen Umrandung auf beiden Seiten ein. Hebe das kaudale Ende der zentralen Platte der Brustwand, die das Brustbein enthält, an, um das Herz freizulegen.
      3. Entfernen Sie das Perikard und machen Sie einen kleinen, präzisen Schnitt in der Spitze des linken Ventrikels, um die Kanüle des Perfusionsapparates freizugeben. Verwenden Sie eine stumpfe Kanüle mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm. Führen Sie die Kanüle vorsichtig durch die Herzkammer, bis die Spitze in der aufsteigenden Aorta erscheint, und befestigen Sie die Kanüle mit einer Klemme. Damit das Blut und die Perfusate aus dem Blutkreislauf austreten können, machen Sie einen Schnitt im rechten Vorhof.
      4. Perfundieren Sie Mäuse transkardial mit einer Peristaltikpumpe bei einer Flussrate von 5 ml/min, zunächst mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder PBS (25 mM, 0,9 % Natriumchlorid oder NaCl, pH 7,4) für ca. 1 min, gefolgt von einem eisgekühlten Fixiermittel für 7 min.
      5. Nach der Fixierung den Mäusekopf mit einer Schere abtrennen und dann die Haut durch die Mittellinie vom Hals bis zur Nase durchschneiden. Entferne den Muskel, um den Schädel vollständig freizulegen.
      6. Machen Sie mit einer scharfen Schere einen Längsschnitt durch die Hinterhaupt- und Interparietalknochen, beginnend mit dem Foramen magnum. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette diese Knochen, um das gesamte Kleinhirn freizulegen. Machen Sie dann einen weiteren Längsschnitt durch die Scheitel- und Stirnknochen bis zum Nasenbein und entfernen Sie sie mit einer Pinzette, um das gesamte Gehirn freizulegen.
      7. Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spatel, ohne es zu beschädigen, und legen Sie es in eiskalte 0,1 M PB.
2. Schneiden und Trimmen der Proben
   1. Schneiden Sie mit Rasierklingen einen koronalen Block von ca. 5 - 6 mm, der den interessierenden Bereich enthält. Kleben Sie es mit einem Cyanacrylatkleber auf die Halterung des Vibroslicers. Richten Sie den Gewebeblock so aus, dass der Neokortex der vibrierenden Klinge zugewandt ist. Koronale Schnitte, die die Amygdala enthalten, werden mit dem Vibroslicer (Abbildung 1A) bei 140 μm in eiskalte 0,1 M PB geschnitten und in einer 6-Well-Schale im selben Puffer gesammelt.
   2. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop die interessierende Region (hier den medio-dorsalen parakapsulären Cluster der interkalierten Zellmassen der Amygdala oder ITC; siehe Abbildung 1B) aus der Scheibe heraus. Führen Sie dies in einer mit Silikonelastomer beschichteten und mit 0,1 M PB gefüllten Petrischale mit einem Augenskalpell durch. Stellen Sie sicher, dass die abgeschnittenen Blöcke in das Loch des Abstandshalters (ca. 1,5 mm) passen (Abbildung 1B).
   3. Bringen Sie die getrimmten Blöcke über Nacht (O/N) bei 6 ºC in Kryoproduktionslösung (30 % Glycerin in 0,1 M PB).

2. Hochdruckgefrieren

HINWEIS: Das Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL) besteht aus 6 wesentlichen Schritten (Abbildung 2): 1) Schnelles Einfrieren mit hohem Druck (bei 2.300 - 2.600 bar) der Probe. 2) Fraktur der Probe. Die Bruchebene folgt im Allgemeinen dem zentralen hydrophoben Kern gefrorener Membranen und spaltet sie in zwei halbmembranige Blättchen: eine Hälfte, die an das Protoplasma angrenzt (P-Fläche) und eine Hälfte, die an den extrazellulären oder exoplasmatischen Raum angrenzt (E-Fläche). 3) Replikation der Probe durch Vakuumabscheidung von Platin und Kohlenstoff. 4) Waschmittel-Verdauung des Gewebes. 5) Immunogold-Markierung. 6) Analyse des Nachbaus mit einem Transmissionselektronenmikroskop.

1. Vorbereitung von Kupferträgern
   HINWEIS: Um die aufeinanderfolgenden Phasen des FRIL-Verfahrens zu durchlaufen, müssen die Proben auf Metallträger (Gold oder Kupfer) montiert werden. Diese Träger variieren in Größe und Bauform je nach Art des Brechens und der Art der verwendeten Maschinen. Hier verwendeten wir Kupferträger (Abbildung 1B, E) und einen aufklappbaren "Doppelrepliktisch" (siehe Abbildung 3B), der beim Öffnen einen Zugbruch durch die gefrorene Probe erzeugt (Abbildung 2). Dies ermöglicht es, beide Seiten der gebrochenen Probe zu erhalten und zu replizieren.
   1. Kupferträger mit einem Anlaufentferner unter Verwendung einer Schicht Fensterleder polieren.
   2. Stellen Sie die Träger in einen Glastopf und reinigen Sie sie zweimal mit einem nichtionischen Reinigungsmittel (pH ~1,5) in einem Ultraschallwasserbad, waschen Sie sie dann ausgiebig in Leitungswasser, gefolgt von deionisiertem Wasser, und spülen Sie sie dann zweimal mit Ethanol aus.
   3. Beschallen Sie die Kupferträger 15 min lang in Aceton.
   4. Legen Sie die Träger zum Trocknen auf Filterpapier.
   5. Befestigen Sie einen Ring aus doppelseitigem Klebeband an einem Kupferträger (Abbildung 1C), der als Halteschacht für den abgeschnittenen Block (Halteträger) dient.
2. Einfrieren der Probe
   HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig mit flüssigem Stickstoff um und tragen Sie eine geeignete Schutzbrille.
   1. Schalten Sie die Hochdruck-Gefriereinheit (Abbildung 1F) mindestens 1,5 Stunden lang ein, bevor Sie die Probe einfrieren.
   2. Starten Sie das Heizen, indem Sie die Taste "AIR HEATER" drücken, und backen Sie es 50 Minuten lang aus. Stellen Sie die Lufttemperatur auf 80 °C ein.
   3. Schließen Sie den Stickstofftank an die Hochdruck-Gefriereinheit an und drücken Sie die Taste "STICKSTOFF", um den inneren Dewar mit flüssigem Stickstoff zu füllen. Die Lampe "NITROGEN LEVEL" leuchtet auf. Starten Sie die Kühlung, indem Sie die Taste "Kühlen" drücken.
   4. Drücken Sie die Taste "DRIVE IN", wenn der "NITROGEN LEVEL" erlischt. Prüfen Sie, ob das Hydrauliksystem den Kolben 3 Mal hin und her bewegt.
   5. Drücken Sie die Taste "AUTO" und die Taste "STICKSTOFF". Sobald "READY" aufleuchtet, ist das Hochdruck-Gefriergerät bereit für das Hochdruck-Gefrieren.
   6. Legen Sie einen abgeschnittenen Block in das Loch des doppelseitigen Klebebandes (Abbildung 1B) mit einer Platindrahtschlaufe, die in eine Glaspipette eingeschmolzen wurde.
   7. Entfernen Sie den Überschuss der Kryoprotektivlösung mit Filterpapier oder einer Bürste.
      HINWEIS: Dieses Verfahren ist auch wichtig, um Luftblasen zu entfernen, die sich um das Gewebe herum bilden und eine Verzerrung der Gewebeform und/oder Ultrastruktur verursachen können.
   8. Decken Sie unter einem Stereomikroskop den Halteträger mit einem weiteren Träger ab, so dass der Gewebeblock zwischen den beiden Trägern eingeklemmt ist.
   9. Setzen Sie das Trägersandwich in den Probenhalter des Hochdruck-Gefriergeräts ein (Abbildung 1D). Setzen Sie den Probenhalter in die Hochdruck-Gefriereinheit ein (mit der Spitze nach unten) und sichern Sie ihn durch Einschrauben des Probenhalters.
   10. Starten Sie den Gefrierzyklus durch Drücken der Taste "Jet-Auto". Entfernen Sie so schnell wie möglich den Probenhalter und tauchen Sie die Spitze mit flüssigem Stickstoff in eine isolierte Box. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Pinzettenpaaren in den flüssigen Stickstoff, um sie abzukühlen.
   11. Nehmen Sie das Trägersandwich vorsichtig aus dem Probenhalter und legen Sie es in ein vorgekühltes Kryoröhrchen. Achten Sie darauf, dass die Träger nur mit flüssigstickstoffgekühlten Pinzetten angefasst werden. Kryoröhrchen sollten perforiert werden, damit der Stickstoff aus dem Fläschchen abfließen kann (Abbildung 1G).
   12. Die Schritte 2.2.6 bis 2.2.11 sind so lange zu wiederholen, bis alle gewünschten Proben eingefroren sind. Mehrere Carrier-Sandwiches mit demselben Probentyp können im selben Fläschchen aufbewahrt werden.
   13. Lagern Sie die Kryofläschchen mit den Trägern bis zur Replikation in einem Kryotank (Abbildung 1H).

3. Gefrierfraktur und Replikation

1. Vorbereitung der Elektronenstrahlkanonen
   1. Bevor Sie die Elektronenstrahlkanonen einsetzen, entfernen Sie die Abschirmung mit der "Deflektorplatte". Platzieren Sie die "Einstelllehre", um das Filament durch die untere Kathodenabdeckung in der Spannzange zu zentrieren.
      HINWEIS: Das Ende der Einstelllehre mit größerem Durchmesser wird für die Kohlepistole verwendet, während das Ende mit kleinerem Durchmesser für die Platinpistole verwendet wird.
   2. Schieben Sie das neue Filament über das Messgerät, bis "die Drucklaminae" die Enden des Filaments klemmen können, um sicherzustellen, dass die Filamentspule nicht schräg liegt.
   3. Entfernen Sie die Einstelllehre und setzen Sie den Kohlestab ein. Befestigen Sie es, indem Sie die Spannzange des Verdampferstangenhalters festziehen und darauf achten, dass die Höhe des Stabendes in der Mitte der zweiten Spule von unten liegt. Bei der Platinpistole sollte die Höhe des Endes des Platinstabes in der Mitte der zweiten Filamentspule von oben liegen.
   4. Setzen Sie die Prallblech wieder ein und setzen Sie die Pistolen in die Gefrierbrucheinheit ein. Reinigen Sie die Pistolen nach Gebrauch mit einem Sandstrahler.
2. Einrichtung der Gefrierbrucheinheit
   1. Schalten Sie die Gefrierbrucheinheit (Abbildung 3A) ein, indem Sie MAINS auf 1 stellen. Eine detaillierte Beschreibung der Gefrierfraktur- und Replikationsverfahren finden Sie in der Bedienungsanleitung des Herstellers.
   2. Vor dem Abkühlen der Gefrierbruchvorrichtung das gesamte Kühlsystem des Gerätes mit warmer Luft ausheizen. Drücken Sie die Taste "Auftauen" im Gerät MTC 010 (Temperiergerät) (Abbildung 3A) und lassen Sie den Ausheizvorgang 45 Minuten lang laufen.
   3. Aktivieren Sie die Vakuumstation. Die Gefrierbrucheinheit arbeitet in der Regel in einem Vakuumbereich von ~^10-6 - ^10-7 mbar.
   4. Stickstofftank füllen und an die Gefrierbrucheinheit anschließen. Vergewissern Sie sich, dass der Ventilhalter trocken ist, und reinigen Sie auch den Eingang des Tanks, bevor Sie den Ventilhalter einsetzen (Feuchtigkeit kann das Vakuum und die Anzeige der N 2-Befüllung des Tanks beeinträchtigen).
   5. Beginnen Sie mit dem Kühlen, indem Sie die Temperatur auf -115 °C einstellen. Das Abkühlen dauert ca. 45 Minuten.
   6. Setzen Sie die Elektronenstrahlkanonen ein und stellen Sie Strom und Spannung so ein, dass die folgenden Verdampfungsparameter erreicht werden:
      Kohlepistole: Drehung an, Position 90°, Kohlenstoffakkumulationsrate 0,1 - 0,2 nm/sec
      Kohlenstoff-Platin-Kanone: Drehung aus, Position 60°, Akkumulationsrate 0,06 - 0,1 nm/sec
      HINWEIS: Wenn eine Pistole nach dem Austausch des Kohlenstoff- oder Platinstabes zum ersten Mal verwendet wird, Vor Gebrauch 3 Minuten lang entgasen.

3. Fracturing und Replikation

   1. Fügen Sie gefrorene Trägersandwiches in eine doppelte Replikationstabelle ein und stellen Sie sicher, dass alle Manipulationen in flüssigem Stickstoff durchgeführt werden.
   2. Übertragen Sie den Doppelrepliktisch auf ein Dewargefäß und befestigen Sie ihn in einem Winkel von 45° an der Probentischaufnahme. Der Gehalt an flüssigem Stickstoff sollte immer über dem Doppelrepliktisch liegen.
   3. Nehmen Sie den Doppelrepliktisch mit dem Tischmanipulator auf und setzen Sie ihn in die Gefrierbrucheinheit auf den Kalttisch ein. Warten Sie ca. 20 Minuten, bis sich die Temperatur des Doppelrepliktisches auf -115 °C eingestellt hat.
   4. Prüfen Sie, ob das Vakuum unter ^10-6 mbar liegt und die Temperatur -115 °C beträgt.
   5. Brechen Sie das Gewebe durch manuelle Drehung des Rades gegen den Uhrzeigersinn, das mit der Abdeckung verbunden ist, die über dem Doppelrepliktisch platziert ist. Wenn sich die Hülle dreht, zwingt sie den doppelten Repliktisch zum Öffnen und bricht das Gewebe.
   6. Drücken Sie die Taste "High Tension" in der Vorrichtung EVM 030 (Elektronenstrahlverdampfungssteuergerät) der Gefrierbrucheinheit (Abbildung 3A).
   7. Replizieren Sie die freiliegenden Oberflächen des frakturierten Gewebes (Abbildung 3C) durch Verdampfen von Kohlenstoff (rotierend) mittels einer in einem 90°-Winkel positionierten Elektronenstrahlkanone bis zu einer Dicke von 5 nm, gefolgt von einer unidirektionalen Abschattung mit Platin-Kohlenstoff in einem Winkel von 60° bis zu einer Dicke von 2 nm. Zum Schluss tragen Sie eine 15 nm dicke Schicht Carbon aus einem 90°-Winkel (rotierend) auf.
   8. Für die Verdampfung sind folgende Parameter zu verwenden:
      1. Kohlenstoff: Drehung an, Position 90°; Geschwindigkeit 0,1 - 0,2 nm/sec; 5 nm
      2. Kohlenstoff-Platin: Position 60°; Geschwindigkeit 0,06 - 0,1 nm/sec; 2 nm
      3. Kohlenstoff: Drehung an, Position 90°; Geschwindigkeit 0,3 - 0,5 nm/sec; 15 nm
   9. Entnehmen Sie die replizierten Proben aus der Gefrierbrucheinheit und übertragen Sie sie auf eine keramische 12-Well-Platte (Abbildung 4A), die mit TBS ( Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4).
   10. Entfernen Sie mit einem Platinschlaufendraht das replizierte Gewebe vom Probenträger (Abbildung 4A).
   11. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1 bis 3.3.10, bis alle Beispiele repliziert wurden.

   4. SDS-Aufschluss der Replik

   1. Übertragen Sie die Replik in ein 4 ml Glasfläschchen, gefüllt mit 1 ml SDS-Aufschlusspuffer (2,5% Natriumlaurylsulfat, 20% Saccharose in 15 mM Tris, pH 8,3). 18 Std. bei 80 °C unter Schütteln (45 Hübe/min) aufschließen.
   2. Die Repliken werden in ein neues, mit SDS-Aufschlusspuffer gefülltes Röhrchen überführt und bei RT gelagert.

4. Immunolabeling

HINWEIS: Alle Inkubationen werden bei RT mit leichtem Schütteln durchgeführt, mit Ausnahme von Inkubationen mit Antikörpern.

1. Waschen Sie die Replik 10 Minuten lang in frischem Natriumdodecylsulfat (SDS)-Aufschlusspuffer
.
2. Waschen Sie die Replik einmal mit 2,5 % BSA (Rinderserumalbumin) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung oder TBS für 5 min, und dann 3 x 10 min mit 0,1 % BSA in TBS.
3. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen in TBS mit 5 % BSA für 1 Stunde.
4. Primäre Antikörper in 2 % BSA-TBS verdünnt auftragen. Inkubationen in einem 30-μl-Tropfen (Abbildung 4B) in einer feuchten Kammer bei 15 °C für 72 Stunden durchführen (Abbildung 4C).
   1. Für diese Studie verarbeiten Sie beide Repliken aus dem gebrochenen Gewebe. Inkubieren Sie eine Replik mit einem polyklonalen Meerschweinchen-Antikörper, der gegen die Aminosäuren 717 - 754 des Maus-GluR1 gezüchtet wurde, das allen α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure-Rezeptor- oder AMPA-R-Untereinheiten gemeinsam ist (Verdünnung: 1:200) oder mit einem monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen ein rekombinantes Fusionsprotein gezüchtet wurde, das die Aminosäuren 660 - 811 der NR1-Untereinheit des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptors oder NMDA-R bedeckt (Verdünnung: 1:500) und ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen das grün fluoreszierende Protein aufgebracht wurde (Verdünnung: 1:300).
   2. Die andere Replik wird mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper inkubiert, der gegen ein synthetisches Peptid gezüchtet wurde, das den Aminosäuren 384 - 398 des Ratten-μ-Opioid-Rezeptors entspricht (Verdünnung: 1:500).
5. In TBS mit 0,05 % BSA (3 x 5 Min.) waschen.
6. Sekundäre Antikörper auftragen. Verwenden Sie für diese Studie goldkonjugierte Antikörper (5 nm für ionotrope Glutamatrezeptoren, 10 für μ-Opioid-Rezeptoren und/oder 15 nm für Channelrhodopsin-2 Yellow Fluorescent Protein oder ChR2-YFP) konjugierte Antikörper, die in TBS mit 2 % BSA verdünnt sind. Sekundärantikörper 1:30 verdünnen und in einem 30 μl Tropfen bei 15 °C O/N inkubieren.
7. 3 x 5 min in 0,05 % BSA-TBS bei RT waschen.
8. 2 x 5 min in Reinstwasser waschen.
9. Montieren Sie die Replik auf einem formvar-beschichteten 100-zeiligen Parallelstangengitter (Abbildung 4D).

Ergebnisse

Abbildung 1. Gewebevorbereitung und Hochdruckgefrieren. (A) Der Vibroslicer wird verwendet, um das Gewebe zu schneiden. (B) Ein daraus resultierender koronaler Schnitt des Mausgehirns, der die Amygdala enth...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gewebepräparation
Paraformaldehyd EM-Qualität	Agar Scientific Ltd., Vereinigtes Königreich	AGR1018
Gesättigte Pikrinsäurelösung	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Deutschland	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Deutschland	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Deutschland	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Deutschland	T198.1
Thiopental	Sandoz, Österreich	5,133
Glycerin	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure Reinstwassersystem	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Schlauchpumpe	ISMATEC, Deutschland	ISM 930C
Filterpapier	MACHEREY-NAGEL, Deutschland	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Österreich
Ophthalmic Scalpel	Alcon Laboratories, USA
Perfusionskanüle	Vieweg, Deutschland	F560088-1
Hochdruck-Gefrieren
Kupferträger	Ingenieurbüro M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Deutschland
Gamslederleder	Haushaltswarengeschäft
Locher, 1,5mm	Stubai, Österreich
Denaturiertes Ethanol	Donauchem, Österreich
Aceton	Roth, Deutschland	9372.5
Hochdruck-Gefriermaschine HPM 010	BalTec, CH; jetzt Leica Microsystems	HPM010
Stereomikroskop	Olympus, Japan	SZX10
Flüssigstickstoff
Kryo-Fläschchen	Roth, Deutschland	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Lagergefäß für flüssigen Stickstoff	Cryopal, Frankreich	GT38
Nichtionisches Waschmittel (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Deutschland
Gefrierfraktur und Replikation
Sandstrahler, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Deutschland	SANDURET 2-K
Siliziumcarbid SIC 360, Korngröße 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Deutschland	955932
Gefrierbruchsystem BAF 060	BalTec, CH; jetzt Leica Microsystems	BAF060
Keramik 12-Well-Platte	Gröpel, Österreich	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma Hydrochlorid	SIGMA, USA	T3253
Natriumchlorid	Merck, Deutschland	1,06,40,41,000
SDS, Natriumlaurylsulfat	Roth, Deutschland	5136.1
Saccharose	Merck, Deutschland	1,07,68,71.000
TRIS	Roth, Deutschland	5429.3
Universal-Hybridisierungsofen	Bindemittel, Deutschland	7001-0050
Immunmarkierung
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anti-GFP-Antikörper	Molecular Probes, USA	A11122
Anti-pan-AMPAR-Antikörper	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1-Antikörper, Klon 54.1	Merck Millipore, Deutschland	MAB363
Opioidrezeptor-Mu (MOR)-Antikörper	ImmunoStar, USA	24216
EM Ziegen-Anti-Meerschweinchen, 5nm; Sekundärer Antikörper	BBInternational,	EM. GAG5
EM Anti-Kaninchen für Ziegen, 15nm; Sekundärer Antikörper	BBInternational,	EM. GAR15
Esel-Anti-Kaninchen, 10nm, Sekundärantikörper	AURION, Niederlande	DAR 10nm
Kupfergitter, 100 parallele Stäbe	Agar wissenschaftlich, UK	G2012C
Inkubator	Wichtige Wissenschaft, USA	MO-RC
Pioloform-Pulver	Agar wissenschaftlich, Großbritannien	R1275
Chloroform	Roth, Deutschland	3313.1

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