Gleichzeitige Plethysmographie und Elektromyographie-Aufzeichnung in einem ALS-Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Jensen, V. N., et al. Wiederholte Messung der Aktivität und Ventilation der Atemmuskulatur in Mausmodellen für neuromuskuläre Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt die Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Plethysmographie- und Elektromyographie-Signalen in einem frei beweglichen ALS-Mausmodell. Das Verfahren umfasst die Verwendung von implantierten Elektroden und einem Transmitter, um die Muskelaktivität zu erfassen, sowie eine Plethysmographie-Kammer zur Überwachung der Atemmuster, um die Rolle der akzessorischen Muskeln bei der ALS-Maus zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Maus für die Operation

1. Wählen Sie die gewünschte Maus für die Implantation (d.h. SOD1(G93A) oder Kontrolle) und wiegen Sie das Tier.
   HINWEIS: Das empfohlene Alter und Gewicht für eine Maus (männlich oder weiblich), die sich dieser Operation unterzieht, beträgt P56 - P120 bzw. ≥ 24 g.
2. Betäuben Sie die Maus unter 3,5 % Isofluran mit einer Sauerstoffflussrate von 2 l/min. Führen Sie eine Zehenkneifung und eine Schwanzkneifung durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist.
3. Nehmen Sie nach der Betäubung die Maus aus der Drop-Box und halten Sie die Narkose über einen Nasenkonus aufrecht, indem Sie den Isofluranspiegel auf 1,5 % und die Sauerstoffflussrate auf 1 l/min einstellen. Führen Sie eine Zehenkneifung und/oder eine Schwanzklemme durch, um sicherzustellen, dass die Anästhesie aufrechterhalten wird.
4. Tragen Sie Gleitgel mit Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Augen während der Operation zu verhindern.
5. Rasieren Sie die Maus, um eine Operationsstelle zwischen Ohr und Schulter freizulegen (Abbildung 1C).
6. Befestigen Sie die Zehennägel ipsilateral an der Operationsstelle, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass die Maus während des Heilungsprozesses die Elektroden herauszieht oder Wunden durch Kratzer verursacht.
7. Abtupfen Sie die Operationsstelle abwechselnd, zuerst mit Desinfektionsmittel und dann mit Isopropanol. Wiederholen Sie dies noch 2 Mal.

2. Implantation des Telemetriegeräts zur Aufzeichnung der Skalen- und Trapez-Elektromyographie (EMG)-Aktivität

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1. Legen Sie das Tier unter ein Seziermikroskop, legen Sie es auf die Seite auf ein steriles Pad, das ein Heizkissen bedeckt, und befestigen Sie den Nasenkonus mit Klebeband. Beachten Sie, dass es am besten ist, die rechte Seite zu implantieren, um das vom Herzen ausgehende Elektrokardiogramm (EKG)-Signal zu reduzieren.
   HINWEIS: Überwachen Sie die Atmung und passen Sie die Isofluranspiegel an, falls erforderlich, um eine regelmäßige Atemfrequenz und eine geeignete chirurgische Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.
2. Ziehe das vordere Glied entlang des Rumpfes in Richtung des ipsilateralen Fußes.
   HINWEIS: Diese Position verlagert das Schulterblatt nach kaudal und ermöglicht so einen chirurgischen Zugang zu den Skalen- und Trapezmuskeln.
   1. Nehmen Sie die stumpfe, gebogene Pinzette, halten Sie die Vorderpfote ipsilateral zur Operationsstelle zurück und kleben Sie die Pfote fest (Abbildung 1C). Verwenden Sie ein starkes chirurgisches Klebeband, um sicherzustellen, dass die Pfote für die Dauer des Eingriffs sicher ist.
3. Ziehen Sie ein frisches Paar OP-Handschuhe an. Machen Sie mit dem Skalpell einen etwa 2 cm langen schrägen Schnitt zwischen Schulter und Ohr (rote Linie in Abbildung 1C).
4. Ziehen Sie mit zwei Laminektomiezangen #2, eine in jeder Hand, das Fettpolster zurück und spreizen Sie die Trapez- und Platysmamuskeln, um die Faszie freizulegen, die die Muskeln sternocleidomastoideus und Skalenmuskeln bedeckt (Abbildung 1D und E).
5. Verwenden Sie den blassen M. sternocleidomastoideus und den Nervus phrenicus als Orientierungspunkte, um die Musculus scalene zu identifizieren. Beachten Sie, dass der Nervus phrenicus parallel zu den Musculus scalene verläuft,, während der Sternocleidomastoideus inferior liegt. Die Schuppenmuskulatur verläuft schräg von den Halswirbeln bis zu den Rippen unter dem Trapezmuskel. Biopotentielle Elektroden werden in den vorderen Skalenmuskel eingeführt, der als der Muskel identifiziert werden kann, der neben dem Nervus phrenicus verläuft (Abbildung 1F und G).
   HINWEIS: Vorsicht. Dieser Bereich ist stark vaskularisiert, und es muss darauf geachtet werden, dass die Arteria subclavia nicht durchtrennt wird. Vermeiden Sie eine Schädigung des Nervus phrenicus und des Plexus brachialis.
6. Sobald die Skalen- und Trapezmuskeln identifiziert sind (Abbildung 1G), wird auf dem Rücken des Tieres zwischen den Schulterblättern eine subkutane Tasche für den Transmitter angelegt.
   1. Verwenden Sie die Gewebetrennschere. Führen Sie die stumpfen Spitzen knapp unter die Haut ein und spreizen Sie sie, bis eine Taschenöffnung entsteht, die etwa 1,25x so breit ist wie der Sender (Abbildung 1H).
      HINWEIS: Der Sender sollte mit minimalem Widerstand eingesetzt werden, aber die Tasche sollte nicht so groß sein, dass sich der Sender von selbst bewegen kann. Wenn die Tasche zu klein ist, könnte der Sender an der Haut reiben, was zu Reizungen führen kann, die das Tier dazu veranlassen können, die Haut zu kratzen und/oder das Kabel herauszuziehen. Ist die Tasche zu groß, könnten sich Serome bilden, oder der Sender könnte in eine ungünstige Position wandern.
7. Spülen Sie mit warmer, steriler Kochsalzlösung und führen Sie den Transmitter mit der flacheren Seite gegen den Muskel ein. Positionieren Sie den Sender so, dass er flach liegt und die Drähte aus der Tasche herausragen, parallel zueinander und nicht verdreht (Abbildung 1I). Locken Sie überschüssige Drahtlängen unter das Gerät und legen Sie es flach hin.
8. Führen Sie die Elektroden vom Sender zu den Muskeln für Skalen- und Trapezmuskeln, so dass die beiden Sätze bipotentialer Elektroden flach und parallel zueinander liegen.
9. Trennen Sie mit der Laminektomiezange die vordere Skalena von den umgebenden Muskeln und führen Sie eine 25-Gauge-Nadel senkrecht zu den Muskelfasern durch den Skalenmuskel ein.
   1. Führen Sie eine Elektrode in die Spitze der Nadel ein und ziehen Sie dann die Nadel aus dem Muskel heraus, wobei Sie die in den Muskel eingeführte Elektrode bis zur Isolierung des Drahtes hinter sich lassen (Abbildung 1J und K). Notieren Sie, welche farbigen Elektroden in welchen Muskel eingeführt werden.
10. Geben Sie einen kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber auf das freiliegende Ende des Drahtes, in der Nähe des Muskels, in dem die Elektrode eingeführt wird, und schieben Sie die Elektrodenkappe schnell über den Draht, so dass kein Draht zwischen der Elektrodenkappe und dem Muskel freiliegt (Abbildung 2A und B).
    HINWEIS: Obwohl es eine akzeptierte Praxis ist, EMG-Elektroden mit Cyanacrylat zu sichern, besteht eine alternative Methode darin, einen Seidennahtknoten um die Elektrodenkappe zu binden.
11. Schneiden Sie den überschüssigen Draht distal an der Kappe ab und tragen Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf das Ende der Bleikappe/des Bleidrahts auf. Geben Sie dem Kleber Zeit zum Polymerisieren, bevor er sich löst (Abbildung 2C und D).
12. Befolgen Sie die gleichen Schritte (Schritte 3.10-3.12), um die Elektrode mit entgegengesetzter Polarität parallel zur ersten in denselben Muskel einzuführen, 1 - 2 mm von der ersten Elektrode entfernt.
13. Wiederholen Sie die Schritte 3.10 - 3.12, um Elektroden in den Trapezmuskel einzuführen, der sich direkt vor dem Skalenmuskel befindet (Abbildungen 1L und M).
14. Stellen Sie sicher, dass die Drahtleinen fest an Ort und Stelle sind und dass gerade genug Spiel vorhanden ist, damit das Tier Körperbewegungen ausführen kann, ohne daran zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass überschüssige Bleilänge nicht gegen die Haut drückt, da dies zu Reizungen führen kann, die das Tier dazu veranlassen können, die Leine zu kratzen oder herauszuziehen. Positionieren Sie die Elektroden bei Bedarf neu, um mögliche Beschwerden zu vermeiden.
15. Entferne vorsichtig das Klebeband, das das Vorderglied festhält. Ziehe das Fettpolster zurück über den Muskel und bedecke damit die eingeführten Elektroden. Verschließen Sie den Schnitt mit Cyanacrylatkleber, indem Sie die Hautlappen wieder zusammenziehen, so dass der Schnitt ausgerichtet ist. Drücken Sie einen Teil der Hautlappen mit der gebogenen Pinzette zusammen und tragen Sie entlang dieser Linie eine kleine Linie Cyanacrylatkleber auf.
16. Injizieren Sie 0,1 ml Carprofen subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern, während das Tier noch unter Narkose steht.
    HINWEIS: Verabreichen Sie weiterhin 0,1 ml Carprofen einmal täglich für 1 - 2 Tage nach der Operation und danach nach Bedarf.
17. Nehmen Sie das Tier aus dem Nasenkonus und setzen Sie es in einen sauberen Käfig in den vorgewärmten Brutschrank, bis es wach ist und sich freiwillig im Käfig bewegt. Lassen Sie das Tier danach mindestens 15 Minuten lang im Inkubator und überwachen Sie seine Bewegungen und Wachsamkeit.

3. Postoperative Versorgung

1. Haustiere nach der Operation getrennt unterbringen. Versorgen Sie heilende Tiere mit Diätgel und einer Wasserflasche.
2. Überwachen Sie das Tier in den ersten 30 Minuten nach der Operation. Kontrollieren Sie das Tier mindestens stündlich für 5 Stunden nach der Operation. In den Tagen nach der Operation mindestens zweimal täglich kontrollieren.
3. Achten Sie auf Nekrosen, Infektionen entlang des Schnitts und in der Körperhöhle, in der sich das Implantat befindet (, d. h. Hitze, Schwellung und Rötung) und Serombildung.
   HINWEIS: Diese Symptome treten innerhalb der ersten Woche nach der Operation auf. Abbildung 1N zeigt ein gesundes, geheiltes Tier einen Monat nach der Operation. Obwohl EMG-Aufzeichnungen unmittelbar nach der Implantation gemacht werden können, haben die Tiere mindestens eine Woche Zeit, um zu heilen, bevor sie EMG und Plethysmographie aufzeichnen, da die EKG-Signale unmittelbar nach der Implantation hoch sein können.

4. Erfassen von simultanen Elektromyographie- und Plethysmographie-Signalen

1. Schalten Sie alle Erfassungsgeräte ein, einschließlich des Bias-Flows.
   HINWEIS: Die Durchflussrate für Mäuse ist in der Regel auf 1,0 l/min eingestellt.
2. Kalibrieren Sie die Plethysmographie-Kammer(n) mit einem Durchflussmesser.
   HINWEIS: Überprüfen Sie regelmäßig die Plethysmographie-Kammern, um sicherzustellen, dass die Dichtungen nicht gerissen oder gebrochen sind. Um ihren guten Zustand zu erhalten, beschichten Sie die Gummidichtungen einmal pro Woche mit einem Schmiermittel wie Vakuumfett.
3. Kalibrierung des Eingangstransmitters gemäß den Angaben des Herstellers.
4. Platzieren Sie die Maus für mindestens 1 h in der Plethysmographie-Kammer, um sie zu akklimatisieren, bevor Sie EMG und Plethysmographie aufzeichnen. Durch die Verwendung mehrerer Kammern ist es möglich, von einer Maus aufzunehmen, während sich die nächste Maus in einer zweiten Kammer akklimatisiert. Schalten Sie den Sender während der Eingewöhnungsphase nicht ein, um Batteriestrom zu sparen (Abbildung 1O).
5. Schalten Sie vor der Aufzeichnung (aber nach der Kalibrierung) den Sender ein, indem Sie einen starken Magneten in einem Abstand von 1 Zoll zum implantierten Tier platzieren. Ein rotes Licht an der Vorderseite des Empfängers zeigt an, wenn der Sender eingeschaltet ist.
6. Starten Sie die Akquise über das Pulldown-Menü mit der Bezeichnung "Akquisition" und wählen Sie "Akquise starten". Obwohl die Aufzeichnungsdauer je nach Experiment variieren kann, dauert eine typische Plethysmographie- und EMG-Aufzeichnung 1 - 3 Stunden.
   HINWEIS: Der Sender hat eine intrinsische Abtastrate von 240 Hz. In der Software ist eine schnellere Rate von 500 Hz eingestellt, um zwischen den Punkten zu interpolieren und eine glattere Wellenform zu erzeugen. Der Tiefpassfilter (der als Anti-Aliasing-Filter dient) und der Hochpassfilter im Implantat geben die Bandbreite von 1 bis 50 Hz für dieses Telemetriegerät an. 60-Hz-A/C-Störungen tragen nicht zu übermäßigem Rauschen im EMG-Signal bei, da die Implantate batteriebetrieben sind und das Tier das Implantat und die Elektroden vor elektrischen Feldern abschirmt. Plethysmographie, EMG und Video werden automatisch in Echtzeit über die Erfassungssoftware synchronisiert.
7. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, schalten Sie den Sender mit einem Magneten aus und nehmen Sie das Tier aus der Kammer.

Ergebnisse

Abbildung 1. Implantation eines Telemetriegeräts zur Messung des EMG der Atemmuskulatur. (A) Telemetriesender mit zwei Paaren biopotentieller Elektroden zur Messung des EMG. Die Kabel können auf d...

Materialien