Dieses Protokoll beschreibt die kontrollierte Infusion von autologem Blut in die pontine Region des Gehirns einer Ratte, um eine massive pontine Blutung zu modellieren. Der Zweck besteht darin, eine lokalisierte Gehirnblutung zu simulieren, indem der lokale Druck erhöht wird.
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Methodenartikel
Induktion einer massiven pontinen Blutung in einem Rattenmodell durch autologe Blutinjektion
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
- Tier und Instrumente
- Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht 250 ± 10 g.
- Halten Sie die Ratten mindestens 7 Tage vor der Operation unter kontrollierten Umgebungsbedingungen mit einer Umgebungstemperatur von 25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 65% und einem 12/12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
- Stellen Sie Nahrung und Wasser ohne Begrenzung zur Verfügung.
- Bereiten Sie die Instrumente vor (Abbildung 1A-E).
2. Injizieren Sie das Blut in den pons
- Wiegen Sie die Ratten erneut 3 Tage vor der Operation, um Ratten mit geeignetem Körpergewicht für die Experimente auszuwählen.
- Während der 3 Tage vor dem Modellieren trainieren Sie die Ratten, 3 Mal pro Tag auf dem Schwebebalken zu laufen, um sicherzustellen, dass normale Ratten den Schwebebalken ohne Pause passieren können.
- Heizen Sie das Heizkissen vor der Anästhesie auf 37 °C vor.
- Befestigen Sie einen Mikrobohrer an der Halterung am stereotaktischen Rahmen.
- Injizieren Sie den Ratten 50 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin intraperitoneal. Warten Sie, bis keine Reaktion auf das Zusammendrücken der Zehen zu hören ist.
- Transportieren Sie die Ratte in Bauchlage in den stereotaktischen Rahmen. Legen Sie die Ohrbügel über den Gehörgang, um den Kopf zu sichern. Fixieren Sie den Schädel in horizontaler Position, um ein Verdrehen der Injektion zu vermeiden (Abbildung 1F).
- Halten Sie die Anästhesie durch Isofluran (97,5% Sauerstoff und 2,5% Isofluran) durch einen stereotaktischen Nasenkonus mit einer Einlass- und Auslassöffnung aufrecht.
- Verwenden Sie Augensalbe, um die Hornhaut feucht zu halten.
- Rasieren Sie die Haare oberhalb des Schädels mit einem Mikrorasierer.
- Zeichne mit einem Markierungsstift eine 3 cm lange Mittellinie in den Schädel von der Linie des bilateralen Canthus bis 0,5 cm hinter der hinteren Fontanelle, wie in Abbildung 1F gezeigt.
- Tragen Sie das chirurgische Peeling Entoiod kreisförmig auf, beginnend in der Mitte der markierten Mittellinie und nach außen rotierend.
- Platzieren Sie das OP-Tuch.
- Mache einen Schnitt mit einem Skalpell entlang der markierten Mittellinie.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um eventuelles Blut zu entfernen.
- Platzieren Sie ein Stück Pinzette auf jeder Seite des Kopfhautlappens, um den Schädel freizulegen (Abbildung 1G).
- Tauchen Sie ein Wattestäbchen in 0,9% Kochsalzlösung und entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe aus dem Schädelknochen, um zu verhindern, dass sich das Bindegewebe im Mikrobohrer verfängt.
- Markieren Sie den Mittelpunkt des Bregmas mit einem Markierungsstift als Ursprungspunkt.
- Führen Sie eine Kraniotomie (1 mm Durchmesser) mit einem Mikrobohrer bei AP-9,0 mm, Breitengrad 0 mm durch (Abbildung 2B und Tabelle 1). Gehen Sie vorsichtig vor, da sich dieser Punkt sehr nahe an der venösen Nasennebenhöhle befindet (Abbildung 1G).
- Entfernen Sie den Mikrobohrer aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Setzen Sie eine 100 μl Hamilton-Spritze in den stereotaktischen Halter ein (Abbildung 1K). Schalten Sie den Schalter für die Injektionspumpe ein, klicken Sie auf die Schaltfläche Schnelle Inhalation, aspirieren Sie Heparinlösung (12500 U verdünnt in 100 mL Kochsalzlösung) auf 100 μl und lassen Sie sie dann vollständig ab, um eine zu schnelle Blutgerinnung zu verhindern.
- Tragen Sie mindestens 3 Mal Chlorhexidin und 75% Alkohol chirurgisches Peeling auf den gesamten Schwanz von der Wurzel bis zur Spitze auf, um die Haut zu desinfizieren, die Geilheit zu mildern und die Schwanzvene zu erweitern, um die Erfolgsrate der Injektion zu erhöhen.
- Befestigen Sie eine Kopfhautakupunktur an einer 1-ml-Spritze.
- Führen Sie die Kopfhautakupunktur in eine seitliche Schwanzvene 3 cm von der Schwanzspitze entfernt ein und entnehmen Sie 150 μl Blut (Abbildung 1H).
- Entfernen Sie die Kopfhautakupunktur aus der 1-ml-Spritze.
- Übertragen Sie das Blut in ein Röhrchen (Abbildung 1I).
HINWEIS: Schnell übertragen, um Blutgerinnsel zu verhindern. - Ändern Sie die OP-Handschuhe.
- Wählen Sie den Entnahmemodus, stellen Sie das Volumen auf 100 μl ein, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 200 μl/min ein, klicken Sie auf die Schaltfläche RUN und aspirieren Sie 100 μl Blut in die Hamilton-Spritze (Abbildung 1J).
- Wählen Sie den Infusionsmodus und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 1 μL/min ein.
- Schieben Sie die Spritze vor, bis die Spitze 9,2 mm unter der Oberfläche des Gehirns erreicht (Abbildung 2C und Abbildung 1L).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die ersten 10 μl Blut mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min zu injizieren (Tabelle 1).
- Stoppen Sie die Injektion und lassen Sie die Spritze 20 Minuten lang in Position, um zu verhindern, dass Blut in den Subarachnoidalraum fließt.
- Ziehen Sie die Spritze zurück, bis die Spitze 9,0 mm unter der Oberfläche des Gehirns ankommt.
- Starten Sie die Injektion mit der gleichen Geschwindigkeit von 1 μL/min neu, bis das Restblut vollständig injiziert wurde.
- Lassen Sie die Spritze 10 Minuten lang in Position, um einen Blutrückfluss zu vermeiden.
- Entferne die Spritze langsam aus dem Gehirn.
- Verwenden Sie Knochenzement, um das Kraniotomieloch abzudecken.
- Wenn der Zement trocknet, vernähen Sie die Wunde mit einem 4-0 Polyamid-Nahtfilament. Nach dem Nähen von 3 oder 4 Stichen 2-1-1 Standard-OP-Knoten binden.
- Um eine Infektion zu verhindern, injizieren Sie der Ratte intraperitoneal Penicillin (0,25 ml, 80 IE verdünnt in 4 mL Kochsalzlösung).
- Injizieren Sie den Ratten subkutan Butorphanol-Tartrat (2,5 mg/kg) und wiederholen Sie die Injektion alle 2 Stunden, um postoperative Schmerzen bis 24 Stunden nach der Operation zu lindern.
- Beobachte die Ratte alle 15 Minuten, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Setzen Sie ihn wieder in den ursprünglichen Käfig ein, mit einem Heizkissen unter dem Käfig. Geben Sie der Ratte freien Zugang zu Futter und Wasser bis zur Tötung.
Tabelle 1: Injektion von autologem Blut.
Mild | Moderate | Massiv | |
Total | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
First injection | |||
Stereotaktische Koordinaten | AP -9.0 mm; Breitengrad 0; Vert -9.2 mm | ||
Volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
Geschwindigkeit | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
Interval time | 20 min | 20 min | 20 min |
Second injection< | |||
Stereotactic coordinates | AP -9.0 mm; Breitengrad 0; Vert -9.2 mm | AP -9.0 mm; Breitengrad 0; Vert -9.0 mm | |
Volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
Geschwindigkeit | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
Vor dem Zurückziehen der Nadel | 10 min | 10 min | 10 min |
AP: anteroposterior position | |||
Breitengrad: lateral | |||
Vert: vertical | |||
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Ergebnisse
Abbildung 1: Instrumente und Ablauf der Operation. (A) Anästhesiegerät. (B) Chirurgische Instrumente. (C) Mikrobohrer. (D) Mikro-Einspritzpumpe. (E) Stereotaktische Geräte. (F) In der Mitte des Schädels ist eine Linie markiert. (G) Der gelbe Pfeil zeigt auf die Bohrstelle. (H) Abfluss von Blut aus der Schwanzvene. (I) Übertragen Si...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100ml Kochsalzlösung< | 191222201 C1 | Vorbereiten des Heparin-Verdünnungsmittels | |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injektion von autologem Blut | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Autologes Blut aus der Schwanzvene |
| 75% Alkohol | Shandong Lierkang | Desinfektion von Rattenschwanz | |
| Klebeband | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Tieranästhesiesystem< | R510-31S-6 | Induktion und Aufrechterhaltung der Anästhesie | |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | Für neurologische Defizit-Scores | |
| Knochenzement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | Für die Schmerzbehandlung | |
| Elektrischer Schädelbohrer | Nanjing Darwin biotechnology< | Ein Bohrloch auf dem Schädel machen | |
| EP tube | Nantong Surui | Autologes Blut übertragen | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Augenschutz | |
| Heizkissen | Dangerous Jungle | JR01 | Warm halten |
| Heparin-Natrium-Injektion | Chengdu Haitong Pharmacal Company< | Zubereitung des Heparin-Verdünnungsmittels | |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilisation | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Anästhesie |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injektion von autologem Blut |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020< | |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp needle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Autologes Blut aus der Schwanzvene |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Scherenschere | Shanghai Jinzhong | Y00040< | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | Für chirurgische Positionierung |
| Chirurgisches Handtuch | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Nahtnadel | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Nahtschere | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Gewebehaltezange | Shanghai Jinzhong | J31080< |
