Einfluss von Sauerstoff-Glukose-Entzug und Reoxygenierung auf Zell-Zell-Interaktionen

Zusammenfassung

Quelle: Alluri, H., et.al. Sauerstoff-Glukose-Entzug und Reoxygenierung als In vitro Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranken-Dysfunktion. J. Vis. Exp. (2015).

Das Video zeigt die Auswirkungen von Sauerstoff-Glukose-Entzug und anschließender Reoxygenierung auf mikrovaskuläre Endothelzellen (RBMECs) des Rattengehirns, indem hypoxische und nährstoffarme Bedingungen simuliert werden. Diese Bedingungen führen zu einer ATP-Depletion, einem erhöhten intrazellulären Kalzium und der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die Zellverbindungsproteine abbauen und die Bildung von Stressfasern induzieren, wodurch die Zell-Zell-Interaktionen geschwächt werden.

Protokoll

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p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:12pt;text-align:justify;' dir='ltr'>1. Aussaat von Endothelzellen

1. Beziehen Sie Primärkulturen von RBMECs von erwachsenen Sprague Dawley-Ratten (oder erhalten Sie sie kommerziell).

2. Kultivieren Sie RBMECs in 100 cm mit Fibronektin (50 μg/ml) beschichteten Petrischalen unter Verwendung des Endothelzellwachstums des Rattengehirns Mittel. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Konfluenz erreicht ist.

3. Bei Erreichen einer Konfluenz von 80-90 % waschen Sie die Zellen vorsichtig in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Schwenken. Die Zellen werden dann abgelöst, indem sie 1 ml warmer 0,25%iger Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung ausgesetzt werden, die auf 37 °C äquilibriert wird.

4. Urheberrecht Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2-5 Minuten, bis die Zellen abgelöst und verteilt sind. NOTE: Klopfen Sie auf die Kulturschale, um die Zellen zu lösen. Betrachten Sie Zellen unter dem Mikroskop, um die vollständige Ablösung der Zellen von der Oberfläche der Schale zu bestätigen.

5. Geben Sie 5 ml komplettes Medium in die Petrischale, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie das Medium mit den abgelösten Zellen aus und sammeln Sie es in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.

6. Zentrifugieren Sie das Medium mit Endothelzellen bei 220 x g für 5 Min.

7. Aspirieren Sie den Überstand und konservieren Sie die pellethaltigen Zellen. Suspendieren Sie das Pellet in 3-5 ml frisches Endothelzellwachstumsmedium des Rattengehirns, indem Sie es vorsichtig mit einer Pipette auf und ab mischen. Die Zellen werden dann mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer gezählt.

8. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorbeschichtetes Fibronektin (50 μg/ml) steriles Kammer-Objektträgersystem mit 8 Wells, 0,7 cm²/Well mit einer Seeding-Dichte zwischen 10.000 und 15.000 Zellen pro Well. Vergrößern Sie die Zellen bei 37 °C, bis die Konfluenz erreicht ist NOTE: Für die Durchführung von Western Blots oder anderen Experimenten können Zellen in 10 cm Zellkulturschalen oder speziellen Schalen gezüchtet werden, je nach Bedarf des Experiments.

2. Sauerstoff- und Glukoseentzug-Reoxygenierung In-vitro-Modell

1. Verwenden Sie das Hypoxie-Zellkultursystem, um die Auswirkungen von OGD-R auf RBMECs zu untersuchen (siehe Abbildung 1). Richten Sie das Hypoxie-Zellkultursystem ein und kalibrieren Sie es, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, gemäß den Anweisungen des Herstellers.

2. Entnehmen Sie die Objektträger der konfluenten Kammer (Schritt 1.8) aus dem 37 °C heißen Inkubator. Ersetzen Sie das gesamte Medium in der Kammerfolie durch sauerstoffarmes, glukosefreies Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und legen Sie es für 2 Stunden bei 37 °C in eine Hypoxiekammer mit 95% Stickstoff und 5% Kohlendioxid, um den OGD-Zustand darzustellen.

3. Bringen Sie die Zellen zurück in den Inkubator mit 95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid bei 37 °C und versorgen Sie sie mit frischem Endothelzellen-Medium des Rattengehirns und inkubieren Sie für weitere 1 Stunde bei 37 °C.

HINWEIS: Dieser Schritt stellt eine Reoxygenierungssituation dar.

Ergebnisse

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Proox model 110	Biospherix	model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamin Phalloidin	Life Technologies	R415
ZO-1 Kaninchen Polyklonaler Antikörper	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 gut steril, Glasobjektträger	Thermowissenschaftliche	177402
FITC-getaggt anti-Kaninchen sekundär Antikörper	Santa Cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Jedes andere verfügbare PBS kann verwendet werden