Dieses Video zeigt die Isolierung von Protein-DNA-Komplexen aus Neurosphärenzellen, die aus einem Maushirntumor stammen, mittels nativer Chromatin-Immunpräzipitation. Es beschreibt die Schritte für die Chromatinvorbereitung, die Immunpräzipitation, das Waschen und den Proteinverdau, um DNA für die nachgelagerte Analyse freizusetzen.
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Methodenartikel
Native Chromatin-Immunpräzipitation von Neurosphärenzellen
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Native Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
- Chromatinvorbereitung
- Nach der Bestandsaufnahme der abgeleiteten Neurosphärenzellen (NS) wird NS in einem T-75-Kolben in 15 ml NSC-Medium bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator mit einer Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % CO2 kultiviert, bis NS konfluent wird. Eine konfluente T-75-Platte ergibt 3-5 x 106 Zellen.
- Wenn die Zellen zusammenfließen, zentrifugieren Sie NS bei 300 x g für 5 min, dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie 1 mL Zelldissoziationsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie 5 ml Medium hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
HINWEIS: Pro Immunpräzipitation (IP) werden 1 x 106 Zellen benötigt. Beachten Sie, dass auch ein Präimmunserum oder eine IgG-Kontrolle enthalten sein muss. - Zentrifugen Sie das NS in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei 300 x g für 5 min, dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das NS-Pellet mit 1 mL ausgewogener Salzlösung und übertragen Sie die Suspension in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung.
- Zentrifugieren Sie NS bei 300 x g für 5 min, dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 95 μL Aufschlusspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2, 0,2% Polyethylenglykoloctylphenylether) pro 1 x 106 Zellen, ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail in einer hohen Konzentration (1:100). Pipettieren Sie die Zellen sofort auf und ab, um ein Verklumpen zu verhindern und Blasenbildung zu vermeiden.
- Resuspendieren Sie Mikrokokken-Nuklease (MNase) in 50% Glycerin, um 1 mg/ml-Lösung (1,15 Einheiten/μl, gelagert bei -20 °C) herzustellen, die als "1x"-Stamm bezeichnet wird. Stellen Sie eine "0,1x"-Brühe her, indem Sie eine zweite 1:9-Verdünnung mit 50 % Glycerin (z. B. 900 μl "1x" MNase und 100 μl 50 % Glycerin) durchführen und bei -20 °C lagern.
- Mischen Sie 5 μl "0,1x" MNase und 145 μl Aufschlusspuffer. Halten Sie das Enzym die ganze Zeit auf Eis. 5 μl verdünnte MNase in Verdauungspuffer pro 1 x 106 Zellen zugeben. Schnippen Sie das Röhrchen zum Mischen und stellen Sie das Röhrchen genau 12 Minuten lang in einen 37 °C-Block. Verarbeiten Sie die Proben nacheinander, um eine genaue Inkubationszeit von 12 Minuten zu gewährleisten.
- Füge 10 μl 10x MNase Stopppuffer (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) pro 1 x 106 Zellen hinzu. Ab diesem Zeitpunkt müssen die Proben auf Eis aufbewahrt werden.
- Add 110 μL "2x Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (RIPA) Puffer" (280 mM NaCl, 1,8% Polyethylenglykoloctylphenylether, 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,2% Na-Desoxycholat, 5 mM Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA); gelagert bei 4 °C), ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail in hoher Konzentration (1:100) pro 1 x 106 Zellen. Schnippen Sie die Röhre, um zu mischen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 min lang in einer Mikrofuge bei 4 °C und 1700 x g. Übertragen Sie den Überstand in ein neues, reguläres 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung sind nicht mehr notwendig) und lagern Sie sie auf Eis. Entsorgen Sie das Pellet.
- Immunpräzipitation (IP)
- Mischen Sie die magnetischen Kügelchen Protein A und Protein G im Verhältnis 1:1. Bereiten Sie für jedes IP 25 μl Kügelchen vor.
- Wasche die Kügelchen durch Zugabe von 1 mL RIPA-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% Polyethylenglykoloctylphenylether, 0,1% SDS, 0,1% Na-Desoxycholat; gelagert bei 4 °C) ergänzt mit Proteaseinhibitoren in niedriger Konzentration (1:1000).
- Verwenden Sie einen Magneten, um die Perlen von der Waschlösung trennen zu lassen und die Waschlösung zu dekantieren (ca. 1 min). Führen Sie den Waschschritt zweimal durch.
- Resuspendieren Sie die Kügelchen auf das ursprüngliche Volumen mit RIPA-Puffer, der mit Proteaseinhibitoren (1:1000) ergänzt wird.
- Falls nötig, verdünnen Sie das Chromatin mit RIPA-Puffer, der mit Proteaseinhibitoren (1:1000) ergänzt wird, so dass jede IP ein Volumen von 100-200 μL hat. Reservieren Sie 10% des pro IP verwendeten Volumens des Chromatins für die Eingabe.
HINWEIS: Wenn beispielsweise 200 μl pro IP verwendet werden, sollten 20 μl verdünntes Chromatin für die Eingabe reserviert werden. Bei insgesamt vier IPs sollte das Gesamtchromatinvolumen auf 820 μl verdünnt werden. - Bereiten Sie die Eingabe vor. Geben Sie 100 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), ergänzt mit Proteinase K (0,5 mg/ml), in den Eingang und inkubieren Sie den Eingang 1 h lang bei 55 °C.
- Reinigen Sie den Input mit einem Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie in 50 μl Elutionspuffer, der im Kit enthalten ist.
- Messen Sie die Konzentration des Eingangs mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer und notieren Sie die Ergebnisse in einem Notizbuch. Blank mit Elutionspuffer aus dem Kit.
HINWEIS: In Maus-Neurosphären haben wir ungefähr 6 μg DNA für jede IP verwendet. - Führen Sie die Eingabe auf einem 1%-Gel aus oder laden Sie 1 μl auf einen DNA-Bioanalysator mit den Standardeinstellungen. Speichern Sie den Rest, um ihn als Eingabe in nachgelagerten Anwendungen zu verwenden.
- Fügen Sie 10 μl gewaschene Protein A & G Magnetkügelchen für jede IP hinzu und inkubieren Sie IP für 1 h bei 4 °C.
HINWEIS: Fügen Sie zum Beispiel 30 μL Protein A & G Magnetkügelchen für drei IPs hinzu. - Lege die Proben auf einen Magneten und lasse die Perlen sich trennen. Teilen Sie das Chromatin, indem Sie die zuvor festgelegte Menge in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
- Fügen Sie den Antikörper hinzu und umwickeln Sie die Kappen mit Kunststoffparaffinfolie, um Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C und drehen Sie bei 20 U/min.
HINWEIS: Die Konzentration sollte empirisch gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestimmt werden. - Am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei Raumtemperatur, 2000 x g, für 10 s. Fügen Sie dann 10 μl Kügelchen zu jedem IP hinzu und inkubieren Sie IP 3 Stunden lang bei 4 °C mit einer Drehung bei 20 U/min.
- IP Waschungen und Proteinverdauung
- Fügen Sie jedem IP 150 μl RIPA-Puffer hinzu, ergänzt mit Proteaseinhibitoren in niedriger Konzentration (1:1000), und inkubieren Sie IP bei 4 °C mit Drehung bei 20 U/min für 5 Minuten. Legen Sie die Probe auf einen Magnetständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal.
- Gib 150 μl Lithiumchlorid (LiCl)-Puffer (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0.5 % Na-Desoxycholat; bei 4 °C lagern), ergänzt mit Proteaseinhibitoren in niedriger Konzentration (1:1000) zu jedem IP und inkubierst IP bei 4 °C mit Rotation bei 20 U/min für 5 min. Lege die Probe auf einen magnetischen Ständer und lasse die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.
- Fügen Sie 150 μl kaltes Tris-EDTA (TE) hinzu (keine Proteaseinhibitoren) und inkubieren Sie die Probe bei 4 °C mit einer Drehung bei 20 U/min für 5 Minuten. Legen Sie die Probe auf einen Magnetständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.
- Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Probe in 100 μl TE-Puffer, ergänzt mit Proteinase K (0,5 mg/ml) und inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei 55 °C.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer | |||
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | |||
| C57BL/6 | |||
| Calcium Chloride | |||
| D-Luciferin, Kaliumsalz | |||
| DiaMag1.5 magnetic rack | |||
| DiaMag Rotator EU | |||
| DMEM/F-12 | |||
| Dynabeads Protein A | |||
| Dynabeads Protein G | 10003D | ||
| EGF | PeproTech | ||
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)< | E-4884< | ||
| Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure) (EGTA) | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| FGF | |||
| Forceps | |||
| Glycerin, MB Grade | |||
| HBSS | |||
| Fluriso | |||
| Ivis Spectrum | |||
| Hyqtase | |||
| Lithiumchloride | |||
| Niedrige Bindung microtubes | |||
| Microcentrifuge | |||
| Micrococcal Nuclease | |||
| N2 | |||
| Normocin | |||
| NP-40 (Igepal CA-630) | |||
| Kimble Kontes Pellet Stößel | |||
| Protease Inhibitor Cocktail | |||
| Protinase K | |||
| QIAquick PCR Purification Kit< | |||
| Scalpel | |||
| Sodium Chloride | |||
| Sodium Deoxycholate | |||
| Natriumdodecylsulfat (SDS)< | |||
| Triton X-100< | |||
| Standard Mini Centrifuge | |||
| SZX16 microscope | |||
| Nanodrop One |
