Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind, gefolgt von einer enzymatischen Signalamplifikation, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Die resultierende Fluoreszenz ermöglicht eine Co-Lokalisationsanalyse der Ziel-RNAs innerhalb des Gewebes.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Hybridization

1. Bereiten Sie einen 65 °C Waschpuffer vor: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x salzhaltiges Natriumcitrat), 50% (v/v) Formamid und 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Bereiten Sie den MABT-Puffer vor: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Verdünnen Sie die beiden Sonden (DIG-markiert und FITC-markiert) 1/1.000 in Hybridisierungspuffer (DEPC-behandeltes deionisiertes Wasser mit 50% (v/v) deionisiertem Formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂HPO₄, 0,01 mg/ml Hefe-tRNA, 1× Denhardt-Lösung und 10% w/v Dextransulfat) vorgewärmt auf 65 °C und mischen Sie gut.
4. Tragen Sie etwa 300 μl Hybridisierungsmischung auf jeden Objektträger auf, decken Sie das Deckglas mit ofengebackenen (200 °C) Deckgläsern auf und inkubieren Sie O/N bei 65 °C in einer befeuchteten Kammer.
5. Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas mit vorgewärmtem Waschpuffer. Waschen Sie die Objektträger zweimal 30 min lang bei 65 °C mit Waschpuffer.
6. Waschen Sie die Folien dreimal 10 Minuten lang mit MABT bei RT.

2. Visualisierung der FITC-Sonde

1. Bereiten Sie den ISH-Blockierungspuffer vor: MABT mit 2% Blockierungsreagenz und 10% hitzeinaktiviertem Schafserum.
2. Optional: Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um Kreise um die Gewebeabschnitte auf dem Objektträger zu zeichnen, um das Volumen der benötigten Antikörperlösungen zu reduzieren.
3. Inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei RT mit ISH-Blockierungspuffer in einer befeuchteten Kammer.
4. Inkubieren Sie die Objektträger O/N bei 4 °C mit einem Meerrettichperoxidase (POD)-konjugierten Anti-FITC-Antikörper, verdünnt 1/500 (v/v) in ISH-Blockierungspuffer
.
5. Legen Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas, das PBS mit 0,1% (v/v) Tween-20 (PBST) enthält. 3 Mal für 10 min in PBST waschen und jedes Mal durch frischen PBST ersetzen.
6. Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung das fluoreszierende Tyramid vor, indem Sie es 100 Mal in das Amplifikationsverdünnungsmittel verdünnen. Verwenden Sie für dieses Beispiel FITC-Tyramid.
7. Fügen Sie dies zu den Folien hinzu und lassen Sie es 10 Minuten bei RT stehen.
8. Legen Sie die Dias in ein Coplin-Glas und waschen Sie sie 3 Mal in PBST für 10 Minuten.

3. Visualisierung der DIG-Sonde

1. Bereiten Sie 0,1 M Tris- HCl pH 8,2 vor.
2. Inkubieren Sie die Folien mit ISH-Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT.
3. Inkubieren Sie die Objektträger O/N bei 4 °C mit einem alkalischen Phosphatase (AP) -konjugierten Anti-DIG-Antikörper, verdünnt 1/1.500 (v/v) in ISH-Blockierungspuffer
.
4. Dreimal 10 Minuten lang mit MABT waschen.
5. Zweimal mit 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 für 5 min bei RT waschen.
6. Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung die Fast Red-Lösung vor, indem Sie die Tabletten in 0,1 M Tris pH 8,2 auflösen. Die Lösung durch einen 0,22 μM Filter filtrieren.
7. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 °C mit Fast Red Lösung in einer befeuchteten Kammer. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, sollten Sie die Objektträger regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen, um die Bildung von Niederschlag zu überwachen. Stoppen Sie in diesem Beispiel die Reaktion nach 2 - 3 Stunden.
8. Waschen Sie dreimal 10 Minuten lang mit PBST.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ<
Sodium citrate	Sigma style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:109pt;'>S4641	für 65°C wash buffer
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503<
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379<
Coverslips	VWR International	631-0146<
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959<
Blocking reagenz	Roche	11096176001
Hitzeinaktiviertes Schafserum	Sigma style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:109pt;'>S2263<
Hydrophober pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS<
Deionisiertes Formamid	Sigma	F9037	für ISH-Blockierungspuffer
Natriumchlorid	Sigma	S3014<
Salzsäure	VWR International	20252.29
Natriumphosphat monobasic wasserfrei	Sigma	S8282
Natriumphosphat dibasisches Dihydrat	Sigma	30435<
Hefe tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardts Lösung	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Natriumacetat	Sigma	S2889<
Trizma Base	Sigma	T1503<

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