Immunfluoreszenzfärbung von geleingebettetem, von Patienten stammendem erkranktem fibrovaskulärem Gewebe

Zusammenfassung

Quelle: Gucciardo, E., et. al., Ein Ex-vivo-Gewebekulturmodell für fibrovaskuläre Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie. (2019)

Dieses Video beschreibt ein Immunfärbeprotokoll für ex vivo-Kulturen von fibrovaskulärem Gewebe, das in Fibringel eingebettet ist. Dies ermöglicht eine detaillierte Visualisierung von Gefäßveränderungen, die mit der proliferativen diabetischen Retinopathie einhergehen

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Whole-Mount Immunofluorescence Staining

HINWEIS: Dieses Protokoll dauert 5 Tage und kann bei Bedarf durch Inkubationen über Nacht unterbrochen werden. Lassen Sie die Fibringele zu keinem Zeitpunkt trocknen. Alle Schritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei RT durchgeführt.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor, bevor Sie das Färbeprotokoll starten.
   1. Lösung nach der Fixierung: Bereiten Sie 50:50 Aceton:Methanol-Lösung vor, indem Sie gleiche Mengen Aceton und Methanol mischen (z.B. 50 ml). Bei -20 °C lagern. Bereiten Sie diese Lösung spätestens am Tag vor der Färbung vor. Diese Lösung kann bei -20 °C gelagert und für nachfolgende Färbungen verwendet werden.
      HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung im Abzug vor, da Aceton und Methanol brennbar und gesundheitsschädlich sind.
   2. Blocklösung: Bereiten Sie eine 15%ige fötale Rinderserumlösung (FBS), 0,3% Octylphenolethoxylatlösung in PBS vor, indem Sie zuerst 15% FBS zu PBS hinzufügen. Octylphenolethoxylat zugeben und umrühren, um es aufzulösen. Bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Diese Lösung kann in großen Mengen im Voraus hergestellt, in 15 mL Aliquoten bei -20 °C gelagert und vor der Verwendung am Tag des Beginns des Färbeprotokolls aufgetaut werden. Verwenden Sie für jedes Färbeprotokoll frisch zubereitete oder frisch aufgetaute Aliquots.
   3. Waschlösung: Bereiten Sie 1 l PBS zu, ergänzt mit 0,45% Octylphenolethoxylat, indem Sie 4,5 mL Octylphenolethoxylat zu 995,5 mL PBS hinzufügen. Zum Auflösen umrühren. Bei RT lagern.
2. Hebe die Tröpfchen vorsichtig mit einem quadratischen Spatel aus Edelstahl von der Platte. Lösen Sie den Tropfen zuerst von den Rändern, bevor Sie die Mitte anheben, und geben Sie ihn in eine Vertiefung mit einer 12-Well-Platte, die 1 ml PBS enthält.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte nach der Fixierung, Waschen und Blockieren in diesem Plattenformat durch.
3. Postfixieren Sie die Tröpfchen mit 1 mL eiskalter 50:50 Aceton:Methanol-Lösung für ~1 min (der Rand der Tröpfchen wird weiß).
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt im Abzug durch, da Aceton und Methanol gesundheitsschädlich sind.
4. Spülen Sie mit 3 - 5 Wäschen in 2 mL PBS (die Tröpfchen sinken in die PBS-Lösung, wenn die Rehydrierung abgeschlossen ist).
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Tröpfchen mit der Pipettenspitze zu berühren, da sie nach der Fixierung an Kunststoff kleben. Vermeiden Sie während des gesamten Protokolls das Aspirieren von Postfix-, Antikörper-, Blockierungs- und Waschlösungen durch Saugen, da dies die Tröpfchen beschädigen oder vollständig zerstören kann. Kippen Sie stattdessen die Platte und entfernen Sie die Lösungen vorsichtig mit einer 500-5.000-μl-Pipette.
5. Zentrifugieren Sie die Blocklösung 15 Minuten lang bei 21.000 x g und 4 °C, um Schmutz zu entfernen.
   HINWEIS: Die Lösung kann zur Zentrifugation in 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert werden. Die unbenutzte Lösung kann bei 4 °C gelagert und für alle relevanten Folgeschritte verwendet werden.
6. Inkubieren Sie die Tröpfchen in 500 μL Blockierungslösung für 2 Stunden bei RT.
   HINWEIS: Um das Volumen der verwendeten Blockierungslösung zu reduzieren, kann die Platte auf einer Stütze gekippt werden und es können nur 300 μl Lösung/Tröpfchen verwendet werden.
7. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung (mindestens 30 μL/Tröpfchen) bei geeigneter Verdünnung in Blockierungslösung vor und zentrifugieren Sie sie 15 min lang bei 21.000 x g und 4 °C.
8. Übertragen Sie die Tröpfchen mit einem abgerundeten Spatel in eine runde (U)-untere 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C mit mindestens 30 μl/Tröpfchen der primären Antikörpermischung.
9. Am nächsten Tag die Tröpfchen in eine 12-Well-Platte mit 2 ml Waschlösung/Vertiefung geben, zuerst mit drei 5-minütigen Wäschen spülen und dann mit neun 30-minütigen Wäschen. Lassen Sie die letzte Wäsche (2 mL) über Nacht bei 4 °C.
10. Spülen Sie am nächsten Tag dreimal mit PBS und geben Sie die Tröpfchen in eine runde (U)-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen.
11. Während der Wäschen die entsprechende Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörpermischung (verdünnt 1:500, mindestens 30 μL/Tröpfchen) in Blockierungslösung vorbereiten und 15 min bei 21.000 x g und 4 °C zentrifugieren.
12. Übertragen Sie die Tröpfchen mit einem abgerundeten Spatel in eine runde (U)-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen und inkubieren Sie mit mindestens 30 μl der sekundären Antikörpermischung für 4 h bei RT, geschützt vor Licht.
    HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Inkubationen und Waschschritte lichtgeschützt durch.
13. Übertragen Sie die Tröpfchen mit einem Spatel mit abgerundeten Kanten in eine 12-Well-Platte mit 2 mL Waschlösung/Well, spülen Sie zuerst mit drei 5-minütigen Wäschen und dann mit vier 30-minütigen Wäschen. Lassen Sie die letzte Wäsche (2 mL) über Nacht bei 4 °C.
14. Spülen Sie die Gele am nächsten Tag mit fünf 30-minütigen Wäschen und dann dreimal mit PBS. Lassen Sie die letzte Wäsche (2 mL) über Nacht bei 4 °C.
15. Am nächsten Tag überträgst du die Tröpfchen mit einem Spatel mit abgerundeten Kanten in eine runde (U)-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen und färbst die Kerne gegen, indem du sie mit 10 μg/ml Hoechst-Kernfärbung (mindestens 30 μl/Tröpfchen) für 30 Minuten bei RT inkubierst.
    HINWEIS: Alternativ kann Einbettmedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für die Kerngegenfärbung verwendet werden. In diesem Fall werden dieser Schritt und Schritt 1.16 übersprungen, und es wird direkt mit Schritt 1.17 fortgefahren.
16. Übertragen Sie die Tröpfchen mit einem Spatel mit abgerundeten Kanten in eine 12-Well-Platte mit 2 ml PBS/Well und spülen Sie sie dreimal mit PBS aus.
17. Montieren Sie die Tröpfchen wie folgt auf den Objektträger:
    1. Tragen Sie eine schmale Schicht schnell aushärtendes Eindeckmedium auf die Ränder eines quadratischen Deckglases von 22 mm x 22 mm auf und lassen Sie es ~1 Minute trocknen. Führen Sie diesen Schritt für jeden Tropfen einzeln durch, um eine übermäßige Aushärtung des Einbettmediums zu vermeiden.
       HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt im Abzug durch, da das schnell aushärtende Einbettmedium gesundheitsschädlich ist.
    2. Spülen Sie das Tröpfchen, indem Sie es in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 2 mL deionisiertem Wasser tauchen und mit einem Spatel mit abgerundeten Kanten auf einen Objektträger übertragen. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier.
    3. Geben Sie 15 μl nicht aushärtendes Antifading-Eindeckmedium auf das Tröpfchen.
       HINWEIS: Wenn keine Hoechst-Kernfärbung verwendet wurde, kann alternativ Einbettmedium verwendet werden, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält.
    4. Positionieren Sie das Deckglas vorsichtig mit dem schnell aushärtenden Einbettmedium zum mikroskopischen Objektträger über dem Tropfen und lassen Sie es absetzen.
       HINWEIS: Das schnell aushärtende Medium haftet an dem mikroskopisch kleinen Objektträger und hält das Tröpfchen an Ort und Stelle.
18. Wiederholen Sie Schritt 1.17 für alle Tröpfchen. Montieren Sie zwei Tröpfchen auf jedem Objektträger.
19. Lassen Sie die Dias ~2 h bei RT an der Luft trocknen und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C. Achten Sie darauf, dass die Objektträger horizontal positioniert und vor Licht geschützt sind.
20. Bilden Sie die gefärbten nativen oder Endpunkt-FT-Ex-vivo-Kulturen mit einem konfokalen Mikroskop oder einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop ab, das mit einer optischen Schnittfunktion und einem 20x- oder 40x-Objektiv ausgestattet ist. Verwenden Sie die Kachelfunktion, um einen größeren Bereich des Gewebes auf einmal zu erfassen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Material
Zellkulturplatten, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One<	Wird für Whole-Mount-Immunfluoreszenz
Runde/flache Spatel, Edelstahl	VWR	82027-528<
Deckgläser 22x22mm #1	Menzel/Fisher style='width:160pt;'>15727582	Wird für die
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Wird zum Montieren
Saugfähiges Papier	VWR	115-0202<
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Wird für die Vorbereitung von 1x PBS
Aceton	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Wird zur Vorbereitung der Lösung nach der Fixierung verwendet. GESUNDHEITSSCHÄDLICH: Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder Schutzkleidung. Verwendung in Abzügen.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Wird verwendet, um die Lösung nach der Fixierung vorzubereiten. GIFTIG: Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder -kleidung. Verwendung in Abzügen.
Triton X-100 (Octylphenolethoxylat)	Sigma-Aldrich	T9284<
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249<
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000<
VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200<
Eukitt Schnellhärtende Montage medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder -kleidung und Augenschutz. Verwendung in Abzügen.
Rekombinantes humanes VEGFA	R&D Systems	293-VE-010<
Rekombinantes humanes VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Rekombinanter menschlicher TGFβ	Millipore	GF346<
Rekombinanter menschlicher bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final
CD31 (JC70A)	Dako	M0823<
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Donkey Anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Wird bei einer Verdünnung von 1:100 verwendet, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Verwendet bei einer Verdünnung von 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved Caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664<
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Ziege anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334<
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Verwendet bei 1:1500 Verdünnung, Ziege anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089<
NG2	Millipore	AB5320	Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32<
Prox1	R&D Systems	AF2727	Wird bei einer Verdünnung von 1:40 verwendet, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore<	Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Esel Anti Maus Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198<
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202<
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012<
Alexa Fluor568 Donkey Anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057<
Alexa Fluor568 Goat Anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036<
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molekulare Sonden	A-21468<
Name	Company<	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverses Epifluoreszenzmikroskop	Zeiss		Für die Bildgebung des frischen und in Fibrin eingebetteten FT
AxioImager.Z1 aufrechtes Epifluoreszenzmikroskop mit Apotome	Zeiss		Für die Bildgebung von immungefärbten FT

td style='width:160pt;'>392-0019 verwendettd style='width:194pt;'>Wird für Whole-Mount-Immunfluoreszenzverwendet Montage verwendet verwendettd style='Breite:194pt;'>Wird für die Montage verwendettd style='width:194pt;'>Wird für die Immunfluoreszenz in der gesamten Montierung verwendet. GESUNDHEITSSCHÄDLICH: Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder Schutzkleidung.td style='width:194pt;'>Für die Gegenfärbung von Kernen. GESUNDHEITSSCHÄDLICH: Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder -kleidung sowie Augen- und/oder Gesichtsschutz.td style='width:194pt;'>Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder -kleidung sowie Augenschutz. Verwendung in Abzügen.td style='width:194pt;'>Eindeckmedium mit Kerngegenfärbung. Tragen Sie Schutzhandschuhe und/oder -kleidung sowie einen Augenschutz. Verwendung in Abzügen.td style='width:194pt;'>50 ng/ mL Endkonzentrationtd style='width:194pt;'>1 ng/ ml Endkonzentration concentrationtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Donkey Anti Mouse Alexa 488 Secondary Abtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:200 Verdünnung, Ziege anti Kaninchen Alexa 594 Secondary Abtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Ziege anti Kaninchen Alexa 594 Secondary Abtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:100 Verdünnung, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Abtd style='width:194pt;'>Wird bei einer Verdünnung von 1:200 verwendet, Ziege anti Rabbit Alexa 568 Secondary Abtd style='Breite:160pt;'>MAB3757td style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:400 Verdünnung, Cy3 conjugatedtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:500 Verdünnungtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:500 dilutiontd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:500 Verdünnungtd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:500 dilutiontd style='width:194pt;'>Verwendet bei 1:500 Verdünnungtd style='width:160pt;'>Katalognummer