Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Quelle: Baleriola, J., et. al., Nachweis axonal lokalisierter mRNAs in Hirnschnitten mittels hochauflösender In-situ-Hybridisierung. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt den Nachweis von mRNA in cholinergen Axonen in fixierten Maus-Hippocampus-Schnitten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt die räumliche Lokalisierung von sondenmarkierten mRNAs und Cholinacetyltransferase in cholinergen Neuronen.

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

FISH-Assay, gefolgt von Immunhistochemie mit hitzeinduzierter Antigen-/RNA-Demaskierung
1. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie das gesamte erforderliche Material vor:
  1. Heizen Sie den Hybridisierungsofen auf 40 °C vor und stellen Sie ein Tablett mit destilliertem Wasser in den Ofen, um eine befeuchtete Umgebung zu schaffen.
  2. Nehmen Sie eine Dia-Box und legen Sie in destilliertem Wasser getränkte Papiertücher hinein, um sie zu befeuchten. Stellen Sie dann die Schiebebox in den Hybridisierungsofen.
  3. Nehmen Sie die Sonden (sowohl die negativen als auch die Zielsonden) aus dem Kühlschrank und erhitzen Sie sie 10 Minuten lang im Hybridisierungsofen. Lassen Sie dann die Sonden bei RT abkühlen.
  4. Äquilibrieren Sie die Amplifikationsreagenzien AMP 1-4 (im Fluoreszenz-Multiplex-Reagenzien-Kit enthalten) bei RT.
  5. Bereiten Sie die Antigen-Rückgewinnungslösung vor: 10 mM Natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20. Hinweis: Die Lösung kann unbegrenzt bei RT gelagert und für zukünftige Färbungen verwendet werden.
  6. Bereiten Sie 1x Waschpuffer vor, indem Sie die 50x Stammlösung (im Fluoreszenz-Multiplex-Reagenz-Kit) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser verdünnen.
    HINWEIS: 1x Waschpuffer kann 1 Monat lang bei RT gelagert und für zukünftige Färbungen verwendet werden. 50x Waschpuffer kann ausfallen. Wenn ja, 50x Waschpuffer 10 min bei 40 °C erhitzen, bevor die 1x Lösung hergestellt wird.
2. Dias aus 100% Ethanol entfernen und 5 Minuten bei RT an der Luft trocknen.
3. Bereiten Sie ein Coplin-Glas mit 50 ml Antigen-Rückhollösung vor. Tauchen Sie die Objektträger in eine Antigen-Rückgewinnungslösung und kochen Sie sie 10 Minuten lang in der Mikrowelle.
  HINWEIS: Alternativ können Sie die Objektträger horizontal in eine runde Glasschale mit einem Durchmesser von 100 mm legen, die 100 ml Rückhollösung enthält.
  1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Füllen Sie ein 1-Liter-Becherglas mit destilliertem Wasser und stellen Sie es in die Mikrowelle.
    HINWEIS: Das Wasser "puffert" die Hitze beim Demaskieren.
  2. Legen Sie die Objektträger in eine Antigen-Rückhollösung in die Mikrowelle. Schieben Sie die Folien 5 min lang mit hoher Leistung zum Kochen. Unmittelbar nachdem die Proben aufgehört haben zu sieden, gleitet die Hitze erneut für weitere 5 Minuten mit hoher Leistung.
  3. Kühlen Sie Folien bei RT ab.
    HINWEIS: KRITISCHER SCHRITT: Die Dauer und das Verfahren des Siedens sollten vom Benutzer abhängig von den Eigenschaften der Mikrowelle bestimmt werden. Je schneller das Kochen beginnt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Lösung verdampft. In diesem Fall wird empfohlen, die Proben mehr als zweimal für kürzere Zeiträume zu kochen, um eine Gesamtdemaskierungszeit von 10 Minuten zu erreichen. Im Gegenteil, wenn das Erhitzen bei mittlerer oder niedriger Leistung durchgeführt wird, kann die Demaskierung einmal für 10 Minuten durchgeführt werden. Wenn die Proben jedoch insgesamt etwa 10 Minuten lang nicht kontinuierlich kochen, kann dies zu einer teilweisen Demaskierung sowohl der Ziel-RNA als auch des zu detektierenden Proteins führen.
4. Waschen Sie Folien dreimal mit 1x PBS.
5. Füge 2 - 3 Tropfen (~100 μl) des dapB-Sondensets zu den Gehirnschnitten hinzu, die zur Beurteilung der Hintergrundfärbung verwendet werden. HINWEIS: Das dapB-Sondenset zielt auf ein bakterielles Gen ab und sollte keine Säugetier-RNA erkennen.
6. Füge 2 - 3 Tropfen des Targeting-Sondensets zu den Gehirnschnitten hinzu, die zum Nachweis der interessierenden RNA verwendet werden. HINWEIS: In diesem Beispiel wird ein Sondenset verwendet, das auf die Reste 20 - 1.381 der Atf4-mRNA der Maus abzielt.
7. Decken Sie die Objektträger mit Parafilm ab, um eine Verdunstung der Sonde zu vermeiden, legen Sie sie in die befeuchtete Objektträgerbox im Hybridisierungsofen und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 40 °C.
  HINWEIS: OPTIONAL: Zusätzliche Gehirnschnitte können mit einem Sondenset für die Maus Polr2A hybridisiert und als Positivkontrollen verwendet werden.
8. Waschen Sie die Folien zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
9. Geben Sie 2 - 3 Tropfen Amplifikationsreagenz AMP 1-FL zu jeder Gehirnscheibe, bedecken Sie die Objektträger mit Parafilm, legen Sie sie in die Objektträgerbox und inkubieren Sie sie bei 40 °C für 30 min im Hybridisierungsofen.
10. Waschen Sie die Folien zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
11. Geben Sie 2 - 3 Tropfen Amplifikationsreagenz AMP 2-FL zu jeder Gehirnscheibe, bedecken Sie die Objektträger mit Parafilm, legen Sie sie in die Objektträgerbox und inkubieren Sie sie bei 40 °C für 15 min im Hybridisierungsofen.
12. Waschen Sie die Folien zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
13. Geben Sie 2 - 3 Tropfen Amplifikationsreagenz AMP 3-FL zu jeder Gehirnscheibe, bedecken Sie die Objektträger mit Parafilm, legen Sie sie in die Objektträgerbox und inkubieren Sie sie bei 40 °C für 30 min im Hybridisierungsofen.
14. Waschen Sie die Folien zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT.
15. Geben Sie 2 - 3 Tropfen Amplifikationsreagenz AMP 4-FL zu jeder Gehirnscheibe, bedecken Sie die Objektträger mit Parafilm, legen Sie sie in die Objektträgerbox und inkubieren Sie bei 40 °C für 15 min im Hybridisierungsofen.
16. Waschen Sie die Folien zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und zweimal mit 1x PBS.
17. Geben Sie 100 - 200 μl (oder genug Volumen, um Scheiben vollständig zu bedecken) einer Blockierungslösung, die 3 mg/ml BSA, 100 mM Glycin und 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) enthält, zu den Objektträgern, bedecken Sie sie mit Parafilm und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei RT.
18. Geben Sie 100 - 200 μl Anti-ChAT-Antikörper verdünnt in Blockierungslösung (1/100) zu den Objektträgern, bedecken Sie sie mit Parafilm und inkubieren Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C. Achten Sie darauf, dass die Hirnschnitte nicht austrocknen. Falls erforderlich, tragen Sie die Anti-ChAT-Antikörperlösung 24 Stunden nach der Inkubation erneut auf die Gehirnschnitte auf.
19. Waschen Sie Dias dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT.
20. Fügen Sie 100 - 200 μl des entsprechenden Alexa-konjugierten Sekundärantikörpers (z. B. Alexa-594 Esel-Anti-Ziege für dieses spezielle Beispiel) zu den Objektträgern hinzu, bedecken Sie es mit Parafilm und inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei RT.
21. Waschen Sie Dias dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT.
22. Waschen Sie die Dias einmal mit destilliertem Wasser.
23. Mounten Sie Folien mit einem DAPI-haltigen Montagemedium.
24. Visualisieren Sie Gehirnschnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Advanced Cell Diagnostics	-	Sonde
Benutzerdefinierte Sonde für die Reste 15-1256 der menschlichen ATF4-mRNA (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Negative control probe-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Sonde
Positive Control Sonde-Maus Polr2A (optional)	Advanced Cell Diagnostics<	Probe
Ziegenpolyklonaler Anti-ChAT-Antikörper<	AB144P
ProLong Gold Eindeckmedium mit DAPI	Life Technologies	P36935<
RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Reagenzkit (für die Fluoreszenzdetektion)	Advanced Cell Diagnostics	320850	In-situ-Hybridisierungskit

Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

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