Hochauflösende Bildgebung von Neurotransmitter-Rezeptoren an retinalen Synapsen

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, J., et al. Hochauflösende quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren an retinalen Bandsynapsen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine elektronenmikroskopische Technik zur Visualisierung der Lokalisierung von Neurotransmitterrezeptoren in retinalen Synapsen. Die Netzhautschnitte enthalten retinale Ganglienzellen, die membrangebundene Neurotransmitterrezeptoren aufweisen und mit der Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) markiert sind. Nach der Markierung der Marker mit Gold-Nanopartikel-konjugierten Antikörpern und der Gegenfärbung des Abschnitts mit Schwermetallen werden die RGC-Rezeptoren unter einem Mikroskop sichtbar gemacht.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

1. Retinal Tissue Fixation

1. Stellen Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge zusammen: Ein Präpariermikroskop, 2 Pinzetten mit sehr feinen Spitzen, eine Schere, Zellulosefilterpapier, eine Plastikpipette und einen Objektträger.
2. Betäuben Sie die Ratte in einer geschlossenen Kammer mit 2,0 ml Halothan (einem Inhalationsanästhetikum). Bestimmen Sie eine adäquate Anästhesie mit diesen Methoden: fehlender Rückzug der hinteren Pfote nach einem Zehenkneifen oder fehlender Blinzelreflex. Dann sofort mit der Guillotine enthaupten. Entfernen Sie die Augen mit einer Irisschere und legen Sie sie in eine Glasschale, die 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) bei einem pH-Wert von 7,4 enthält.
3. Entfernen Sie mit dem Präpariermikroskop die Hornhaut, indem Sie die Vorderseite des Augapfels abschneiden. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette von der inneren Netzhautoberfläche.
4. Schälen Sie die Sklera mit den beiden Pinzetten, bis die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert ist.
5. Schneide die Netzhaut sofort mit einem Rasiermesser in 100 - 200 μm dicke Streifen und unterziehe sie einer pH-Shift-Fixierung.
6. Fixieren Sie Netzhautstreifen in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB bei pH 6,0 für 20 - 30 min und dann in 4% Paraformaldehyd plus 0,01% Glutaraldehyd bei pH 10,5 für 10 - 20 min bei Raumtemperatur (RT).
7. Nach mehreren Wäschen in PB mit 0,15 mM CaCl₂ (pH 7,4 bei 4°C) kryokontieren Sie die Netzhautstreifen mit Glycerin (jeweils 60 min in 10%, 20%, 30%, dann über Nacht [O/N] in 30%) in 0,1 M PB, bevor Sie die Gefriersubstitution durchführen.

2. Freeze-substitution

HINWEIS: Diese Freeze-Substitution-Methode wurde von einem früher veröffentlichten Protokoll modifiziert. Außerdem ist es wichtig, dass die Instrumente sehr kalt sind (Handschuhe tragen); Andernfalls kann es vorkommen, dass das Gewebe bei Berührung mit den Instrumenten teilweise auftaut. Alle diese Schritte werden in der automatischen Gefrier-Substitutionskammer (AFS) durchgeführt und die Instrumente dürfen sich niemals über den Rand der Kammer bewegen. Ebenso ist eine ordnungsgemäße Kühlung aller im AFS verwendeten Chemikalien erforderlich.

1. Tauchen Sie die Netzhautstreifen in flüssiges Propan bei -184°C in einem Elektronenmikroskop (EM) Kryokonservierungsinstrument (CPC) ein. Legen Sie die Proben mit einem feinen Pinsel auf kleine Stücke Doppelklebeband, die an den Metallstummeln befestigt sind, die am Ende der Tauchstangen angebracht sind (überschüssigen Puffer mit dem Pinsel ableiten).
2. Tauchen Sie die Stäbe in das flüssige Propan und halten Sie sie dort für etwa 5 Sekunden, und übertragen Sie sie dann in das automatische Gefrier-Substitutionsinstrument (AFS) mit einer kleinen Transportkammer, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist (LN₂ gekühlter Kryo-Transferbehälter).
3. Nachdem Sie die gefrorene Probe und die Instrumente (Pinzette und Skalpell) in das AFS gelegt haben, kühlen Sie die Instrumente in der Kammer für einige Minuten ab, bevor Sie das Gewebe berühren, oder kühlen Sie sie, indem Sie die Spitzen der Instrumente für einige Sekunden in die kleine Transportkammer (gefüllt mit flüssigem Stickstoff (LN₂ gekühlter Kryotransferbehälter)) legen.
4. Sobald du im AFS bist, entferne die Probe und das Klebeband mit einem feinen Skalpell vom Stub. Lassen Sie auch die Stickstoffgasdurchflussregelung TF (TF wird als "Reglersteuerung für LN 2-Verdampfer" bezeichnet) während dieser Vorgänge offen.
5. Bevor du das gefrorene Gewebe in die flachen Einbettungshalter legst (d.h. bevor du das AFS einrichtest), schneide einen dünnen Kreis aus einer durchsichtigen Plastikfolie aus und lege ihn in den Boden des Halters, um den Boden jeder Vertiefung auszukleiden. Dies ermöglicht eine relativ einfachere Entnahme der polymerisierten Probenblöcke im fertigen Zustand.
   HINWEIS: Zuvor haben wir eine alternative Methode zu den flachen Einbettungshaltern verwendet und doppelte Reichert+Gelatine-Kapseln verwendet.
6. Verwenden Sie die folgende automatische Sequenz im AFS (unter Verwendung der Instrumententerminologie): T1 = -90°C für 32 Stunden, S1 = Temperatur um 4°C/h erhöhen (11,3 Stunden), T2 = -45°C für 50 Stunden, S2 = Temperatur um 5°C/Stunde erhöhen (9 Stunden), T3 = 0°C für 40 Stunden (insgesamt = 142,3 Stunden). Es kann 2 bis 4 Stunden dauern, bis die Proben in das AFS (bei -90 °C) gelegt werden, bevor die zeitgesteuerte Sequenz gestartet wird.
7. Tauchen Sie die gefrorenen Abschnitte in 1,5% Uranylacetat in Methanol bei -90°C für >32 Stunden im AFS. Legen Sie (normalerweise) zwei Gewebestücke in jede der sieben Vertiefungen in den flach einbettenden Aluminiumhalter (drei passen in das AFS).
   1. Legen Sie das Gewebe+Klebeband in das Uranylacetat/Methanol in den Vertiefungen und entfernen Sie das Klebeband später, kurz bevor Sie mit der Infiltration des Einbettmediums (z. B. Lowicryl HM20) beginnen, wenn es zu schwierig ist, das Gewebe vom Band zu entfernen.
8. Erhöhen Sie dann die Temperatur schrittweise auf -45°C (+4°C pro Stunde; in der automatischen Reihenfolge).
9. Waschen Sie die Proben dreimal in vorgekühltem Methanol, indem Sie eine Plastikpipette mit feiner Spitze verwenden, um die alte Lösung aus jedem flachen Einbettungshalter zu entfernen, und dann eine andere Standard-Plastikpipette verwenden, um das vorgekühlte frische Methanol hinzuzufügen.
10. Infiltrieren Sie dann mit der gleichen Methode die Proben schrittweise mit Niedertemperatur-Einbettungsharzen wie Einbettungsmedium (HM20/Methanol bei 1:1 und 2:1, jeweils für 2 Stunden, gefolgt von reinem Harz für 2 Stunden und dann wechseln Sie die Harze und behalten Sie O/N).
11. Ändere das Harz am nächsten Tag erneut und passe den Pegel des Harzes so an, dass es gerade bis zur Oberkante der Vertiefungen reicht.
12. Polymerisieren Sie die Proben (-45°C bis 0°C in automatischer Abfolge; +5°C pro Stunde) mit ultraviolettem (UV) Licht für 40 Stunden.
13. Entfernen Sie dann die Samples aus dem AFS. In der Regel weisen Beispielblöcke immer noch eine gewisse Rosafärbung auf. Platzieren Sie die Proben in der Nähe des Fluoreszenzlichts im chemischen Abzug, bei RT O/N oder länger, bis sie vollständig klar erscheinen.

3. Postembedding EM Immunogold Immunocytochemistry

1. Schneiden Sie 1-μm-Schnitte mit Ultramikrotom, färben Sie Schnitte mit 1% Toluidin-Blau und untersuchen Sie sie auf Schnittausrichtung; richten Sie den Gewebeblock aus, um die optimale Querschnittsebene zu erreichen.
2. Schneiden Sie 70 nm dicke ultradünne Schnitte mit Ultramikrotom und sammeln Sie sie auf Formvar-kohlenstoffbeschichteten Nickel-Schlitzgittern.
3. Waschen Sie die Gitter einmal in destilliertem H₂O, gefolgt von einer Tris-gepufferten Kochsalzlösung dreimal (TBS, 0,05 M Tris-Puffer, 0,7% NaCl, pH 7,6).
4. Inkubieren Sie Gitter in 20 μl Tropfen von 5% Rinderserumalbumin (BSA) in TBS für 30 Minuten und dann in 20 μl Tropfen einer Mischung, die Ziegen-Anti-Cholera-Toxin-Untereinheit B (Anti-CTB, 1:3.000) und einen Antikörper gegen eine N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR)-Untereinheit (Anti-Kaninchen-Glutamaterge NMDAR-Untereinheit A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) oder eine Anti-Kaninchen-Untereinheit GluA2/3 (heterotetrametische α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure enthält. [AMPA]-Rezeptor, 1:30) in TBS-Triton (TBST, 0,01 % Triton X-100, pH 7,6) mit 2 % BSA und 0,02 M NaN₃ O/N bei RT.
5. Waschen Sie die Gitter auf drei separate Tropfen (20 μl) TBS (pH 7,6) für 10, 10 und 20 min, gefolgt von TBS (pH 8,2) für 5 min.
6. Inkubieren Sie Gitter für 2 Stunden auf Tropfen (20 μl) einer Mischung, die Esel-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G (IgG, 1:20) enthält, gekoppelt an 10 nm Goldpartikel und Esel-Anti-Ziegen-IgG (1:20), gekoppelt mit 18 nm Goldpartikeln in TBST (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M_{NaN 3}.
7. Waschen Sie die Gitter in 20 μl Tropfen TBS (pH 7,6) für 5, 5 und 10 Minuten, dann in Reinstwasser und trocknen Sie sie dann.
8. Counterstain Gitter mit 5% Uranylacetat und 0,3% Bleicitrat in destilliertem H₂O für 8 bzw. 5 min unter dunklen Bedingungen.

Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Paraformaldehyde	EMS 15710
Glutarldehyde	EMS	16019
Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Verdünnung 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Verdünnung 1/30<
Millipore	AB1506	Verdünnung 1/30<
Millipore	MA1–046	Verdünnung 1/100<
EMS	25704	Verdünnung 1/20
Donkey Anti-Maus IgG-10 nm Goldpartikel	EMS	25814	Verdünnung 1/20<
EMS	25812	Verdünnung 1/20
Donkey Anti-Ziege IgG-18 nm Goldpartikel	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Verdünnung 1/20<
EMS	FCF2010-Ni
Uranylacetat	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Bleicitrat	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromikrotom	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
flüssiger Stickstoff	Roberts Oxygen
Propan	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Verdünnung 1/4000

<td style='height:16.5pt;'>NaHPO4td style='height:14.5pt;'>Anti-GluA2/3td style='height:14.5pt;'>Anti-PSD-95td style='height:14.5pt;'>Donkey Anti-Rabbit IgG-10 nm Goldpartikeltd style='height:15.75pt;'>Donkey Anti-Maus IgG-5 nm Goldpartikeltd style='height:15.75pt;'>Formvar-Carbon beschichtete Nickel-Schlitzgitter.