Dieses Video demonstriert die Methode zur Überwachung der Echtzeitaktivierung von Geruchsrezeptoren in rekombinanten Säugetierzellen mittels Lumineszenzmessung. Die Bindung von Odorierungsstoffen löst die Aktivierung von G-Proteinen und die cAMP-Produktion aus und aktiviert Glosensorproteine, die bei der Substratbindung Lumineszenz abgeben und so ein quantitatives Maß für die Rezeptorreaktion liefern.
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Methodenartikel
Echtzeit-Überwachung der Aktivierung von Geruchsrezeptoren in rekombinanten Zellen
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Hana3A Cells Culture
- Bereiten Sie M10 (Minimum Essential Medium (MEM) plus 10 % v/v fötales Rinderserum (FBS)) und M10PSF (M10 plus 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin und 1,25 μg/ml Amphotericin B) vor.
- Kultivieren Sie die Zellen in 10 mL M10PSF in einer 100 mm Zellkulturschale in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5% Kohlendioxid (CO2) eingestellt ist.
- Teilen Sie die Zellen alle 2 Tage im Verhältnis von 20%: Wenn eine 100%ige Konfluenz der Zellen (ca. 1,1 x 107 Zellen) unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet wird, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 3 ml 0,05% Trypsin-Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA, 0,48 mM) hinzu. Etwa 1 Minute einwirken lassen, bis sich die Zellen von der Platte lösen.
- Fügen Sie 5 ml M10 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren und schließlich die noch an der Platte befestigten Zellen durch Auf- und Abpipettieren zu lösen.
- Übertragen Sie das Volumen (8 mL) auf ein 15 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL M10PSF, indem Sie auf und ab pipettieren, um jegliche Zellmasse aufzubrechen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in der Tube.
- Übertragen Sie 1 ml der resuspendierten Zelllösung in eine neue 100-mm-Zellkulturschale und fügen Sie 9 ml frisches M10PSF hinzu. Bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
2. Vorbereitung der Zellen für die Transfektion
- Bewerten Sie die Konfluenz oder die Anzahl der Zellen, indem Sie sie unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachten. Für eine Platte wird eine Konfluenz von mindestens 10 % (ca. 1,1 x 106 Zellen) benötigt.
- Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml PBS. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 3 ml EDTA hinzu. Etwa 1 Minute bei Raumtemperatur einwirken lassen, bis sich die Zellen von der Platte lösen.
- Fügen Sie 5 ml M10 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren und schließlich die noch an der Platte befestigten Zellen durch Auf- und Abpipettieren zu lösen. Übertragen Sie das Volumen (8 mL) in ein 15 mL-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 200 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 mL M10PSF, indem Sie auf und ab pipettieren, um jegliche Zellmasse aufzubrechen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in der Tube.
- Abhängig von der Anzahl der zu transfizierenden Platten wird eine angemessene Anzahl von Zellen in ein Reservoir mit dem entsprechenden Volumen von M10PSF übertragen. Eine 96-Well-Platte sollte mit 1/10 einer 100 % konfluenten 100-mm-Schale (ca. 1,1 x 106 Zellen) plattiert werden, die in M10PSF verdünnt wird, um ein Gesamtvolumen von 6 ml zu erreichen. Für eine 96-Well-Platte, beginnend mit einer 100 mm Konfluenzschale, fügen Sie 500 μl aus den 5 ml resuspendierter Zellen zu 5,5 ml frischem M10PSF hinzu. Mischen Sie die Zellen und M10PSF, ohne Luftblasen zu erzeugen.
- Pipettieren Sie 50 μl der suspendierten Zellen mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
3. Plasmid Transfection
- Beobachten Sie die 96-Well-Platte unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine Zellkonfluenz zwischen 30% und 50% sicherzustellen.
- Bereite eine erste Transfektionsmischung vor, die die Plasmide enthält, die auf der gesamten Platte vorkommen (eine kürzere Version des Rezeptor-transportierenden Proteins 1 (RTP1S), des Odorant-Rezeptors (OR) und des Glosensor-Proteins; siehe Materialtabelle) gemäß den Volumina in Tabelle 1. Beachten Sie, dass die Anzahl der mit Rho-Tags versehenen ODER durch die Anzahl der ODERs geteilt werden sollte, wenn es sich um mehrere ODER handelt.
HINWEIS: Wir empfehlen dringend, dem Versuchsplan eine leere Vektor-Negativkontrolle (hier Rho-pCI) und jede Positivkontrolle (ODER bekanntermaßen auf den getesteten Geruchsstoff reagierend) hinzuzufügen. - Bereiten Sie eine zweite Transfektionsmischung vor, die 500 μl MEM und 20 μl Lipofectamine 2000 Reagenz enthält (gültig für eine 96-Well-Platte, siehe Materialtabelle). Geben Sie die zweite Mischung zur ersten und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 5 ml M10 hinzufügen und vorsichtig mischen.
- Ersetzen Sie das M10PSF in der zuvor plattierten 96-Well-Platte durch 50 μl des endgültigen Transfektionsmediums. Inkubieren Sie in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist, und vakuumieren Sie die Kammer des Luminometers über Nacht.
4. Substrate Incubation
- Beobachten Sie die 96-Well-Platte unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine Zellkonfluenz zwischen 60% und 100% zu gewährleisten. Bereiten Sie eine Simulationslösung aus Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) vor, die 10 mM Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure (HEPES) und 5 mM D-Glucose enthält.
- Verdünnen Sie 75 μl des zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Reagenzes (siehe Materialtabelle) auf 2,75 ml der Stimulationslösung. Entfernen Sie das Transfektionsmedium aus der 96-Well-Platte und waschen Sie die Zellen, indem Sie 50 μl frische Stimulationslösung in jede Vertiefung geben.
- Entfernen Sie die Stimulationslösung und fügen Sie 25 μl der in Schritt 4.2 hergestellten cAMP-Reagenzlösung in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer dunklen und geruchsfreien Umgebung (z. B. in einer sauberen, leeren Schublade, die weit entfernt von Chemikalien oder Geruchsquellen ist).
5. Odorant Stimulation
- Zuerst die Luminometerkammer mit flüchtigen Geruchsmolekülen ausgleichen. Verdünnen Sie das Odoriermittel in 10 mL Mineralöl auf die gewünschte Konzentration (Abbildung 1A). Geben Sie vor Ablauf der Inkubationszeit des cAMP-Reagenzes 25 μl der Odorierlösung in eine neue 96-Well-Platte (nicht die Platte, die die Zellen enthält). Inkubieren Sie diese Odorierungsplatte bei Raumtemperatur in der Luminometerkammer für 5 min (Abbildung 1B) (hier ist keine Luminometeraufzeichnung erforderlich).
- Stellen Sie das Luminometer so ein, dass es die Lumineszenz mit einer Verzögerung von 0 s während 20 Zyklen der Plattenmessung von 90 s mit einem Intervall von 0,7 s zwischen den Zyklen aufzeichnet.
- Kurz bevor du die Platte liest, entferne die Odorierplatte aus der Kammer. Geben Sie 25 μl Odorant zwischen die Vertiefungen der 96-Well-Platte, die die Zellen enthält (fügen Sie das Odormittel nicht in die Vertiefungen mit den Zellen hinzu) und starten Sie schnell die Lumineszenzmessung aller Vertiefungen für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten (Abbildung 1C).
Tabelle 1: Für Transfektion mischen. Mengen an Plasmiden (Glosensor-Protein, RTP1S und OR), die zu MEM hinzugefügt werden sollen, um sie auf eine 96-Well-Platte zu transfizieren.
Pro 96-Well-Platte | |
MEM | 500 μL |
pGlosensor | 10 ng |
RTP1S | 5 ng |
OR | 75 ng |
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Ergebnisse
Abbildung 1: Schematische Protokolle zur Echtzeitüberwachung der Aktivierung des Odorstoffrezeptors durch verdampftes Odorant. Der Odorant (violett) wurde in Mineralöl (A) in der ...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054< | |
| 100 mm cell culture dish | BD Falke | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 gut, mit LE-Deckel weiß mit klarem Boden Poly-D-Lysin-beschichtetes Polystyrol |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 μg/mL - lagern bei 4 °C |
| Zentrifugenmaschine | Jouan | C312 | Zentrifugenmaschine mit schwingendem Schaufelrotor für 15 mL |
| Class II Type A/B3 Fumehood< | NU-407-500< | ||
| FBS | Gibco | 16000-044< | |
| GloSensor cAMP Reagenz | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagenz lumineszierendes Proteinsubstrat - lagern bei -20 °C |
| Inkubator 37 °C; 5 % Kohlendioxid | Fisher Scientific | 11-676-604< | |
| Lipofectamine 2000 reagenz | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagenz 1mg/ml Transfektionsreagenz - bei 4° lagern C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 Well-Plattenleser für Lumineszenz |
| Mineralöl< | M8410< | ||
| Minimum Essential Medium (MEM)< | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle mit Earle-Salzen & L-Glutamin - bei 4 °C lagern | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333< | |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP lumineszierendes Proteinplasmid - bei 4 °C |
| Phasenkontrast-Mikroskop | Leica | 090-131.001< | |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/μL Plasmid - bei 4°C lagern |
