Induktion der Bildung von Blutgerinnseln im Gehirn von Mäusen mit einem lichtempfindlichen Farbstoff

Zusammenfassung

Quelle: Talley Watts, L., et al. Rose Bengal Photothrombose durch konfokale optische Bildgebung In vivo: Ein Modell des Schlaganfalls mit einem Gefäß. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt eine Technik, um die Bildung von Blutgerinnseln in einem Mäusegehirn zu induzieren. Eine anästhesierte Maus mit einem Schädelfenster und einem ausgedünnten Schädel erleidet eine Photothrombose durch die Aktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoffs unter Verwendung von hochintensivem Licht. Dieser Prozess erzeugt reaktive Sauerstoffspezies, die die Gefäßwände schädigen und die Bildung von Blutgerinnseln auslösen, wodurch letztendlich der Blutfluss zum Gehirn behindert wird.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Anästhesieren zur kortikalen Vorbereitung

1. Die Maus in eine Induktionskammer mit 2-3% Isofluoran gemischt mit Sauerstoff legen, um eine Anästhesie einzuleiten. Beobachten Sie, wie die Atemfrequenz abnimmt, wenn die Maus induziert wird. Kneifen Sie die Pfote der Maus zusammen, um festzustellen, ob die Maus bereit ist, sich zum Nasenkegel zu bewegen. Hinweis: Die Anästhesiestufe ist ein kritischer Schritt bei jeder in vivo Vorbereitung, und es sollte darauf geachtet werden, dass kein Spiegel induziert wird, der eine globale Ischämie verursacht.
2. Sobald die Maus ausreichend anästhesiert ist, bringen Sie das Tier auf die Operations-/Bildgebungsplattform und platzieren Sie die Nase der Maus in den Nasenkegel und tragen Sie 1-1,2% Isofluoran auf, um einen anästhesierten Zustand aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass die Maus auf einem temperaturgesteuerten Heizkissen liegt, um die Körpertemperatur (37 °C +/- 0,5 °C) während der restlichen Eingriffe aufrechtzuerhalten. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
3. Überwachen Sie die Physiologie der Maus mit einem Pulsoximetrie-System unter Verwendung des mit dem System gelieferten Schwanz- oder Fußclips. Überprüfen Sie, ob die Atemfrequenz zwischen 50-65 Atemzügen/min gehalten wird. Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz zwischen 300 und 450 Schlägen pro Minute liegt und die Sauerstoffsättigung zwischen 97 und 98 % gehalten wird, um das langfristige Überleben des Tieres zu gewährleisten.
4. Wenn die Maus ausreichend betäubt ist, rasieren Sie die Haare mit einer elektrischen Haarschneidemaschine, entfernen Sie Resthaare und reinigen Sie sie mit Betadin, gefolgt von einem Ethanoltupfer. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, um eine sterile chirurgische Umgebung zu gewährleisten.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Wenn die Kopfhaut vollständig gereinigt und rasiert ist, machen Sie einen 5 mm großen Schnitt in der Kopfhaut der Maus, um die Schädelrisse freizulegen und das Bregma zu lokalisieren.
2. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollapplikator, um alle verbleibenden Faszien zu entfernen, die über dem Schädel liegen.
3. Kleben Sie einen maßgefertigten Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen über der parietalen Rinde mit den stereotaktischen Koordinaten von Bregma: -1 bis -3 mm und lateral: 2-4 mm. Hinweis: Der Kleber härtet in der Regel innerhalb von 2 Minuten nach dem Platzieren des Rings auf dem Knochen aus.
4. Befestigen Sie den Ring an einer stereotaktischen Halterung (Abbildung 2), um die Maus zu stabilisieren und Bewegungen während der Bildgebung zu verhindern.
5. Bohren Sie unter einem chirurgischen Präpariermikroskop langsam einen 1-2 mm großen Schnitt in den Schädel mit einem drehzahlgeregelten Drenel-ähnlichen Werkzeug (Meisinger 3,9 mm Bohrer) und achten Sie darauf, dass der Bereich beim Bohren eben bleibt. Erreiche dies mit einem Zick-Zack-Muster. Um einen Hitzestau zu vermeiden, stellen Sie die Bohrgeschwindigkeit auf niedrig und machen Sie häufige Pausen.
6. Wenn der Schädelschädel glänzend aussieht, setzen Sie die Ausdünnung des Schädels mit einer Skalpellklinge fort, indem Sie das gleiche Zick-Zack-Muster verwenden, um die verdünnte Oberfläche waagerecht zu halten und eine reibungslose Entfernung dünner Schichten des Schädelschädels zu erleichtern. Machen Sie mit der Spitze der Skalpellklinge kleine lineare Striche mit leichtem Druck, um jeweils dünne Knochenschichten zu entfernen. Fahren Sie fort, bis das Gefäßsystem durch das Präpariermikroskop deutlich sichtbar ist.
7. Wenn der Experimentator den Schädel während des Ausdünnungsprozesses durchsticht oder bricht, euthanasieren Sie das Tier, da die darunter liegende Hirnrinde wahrscheinlich geschädigt ist.
   Hinweis: Der Schädel der Maus ist etwa 300 μm dick und besteht aus zwei dünnen Schichten aus kompaktem Knochen (eine äußere und eine innere Schicht) und einer Schicht aus schwammigem Knochen, die zwischen den beiden Schichten des kompakten Knochens liegen. Die äußere Schicht aus kompaktem Knochen und der größte Teil des schwammigen Knochens werden innerhalb des Bohrbereichs von 5 mm entfernt, so dass eine etwa 50 μm dicke Schicht aus kompaktem Knochen übrig bleibt (siehe Abbildung 2B). Durch die Visualisierung des Gefäßsystems wird sichergestellt, dass der endgültige intakte, ausgedünnte Schädel eine Dicke von etwa 50 μm hat. Der Schädel ist also auch dann noch vorhanden, wenn er auf diese Dicke ausgedünnt wird.

3. Aufbau des Mikroskops

1. Verwenden Sie ein inverses Mikroskopsystem (konventionelle, konfokale oder Zwei-Photonen-Systeme) mit einem Objektivwechselrichter. Hinweis: Es ist auch möglich, ein Standard-Standmikroskop zu verwenden. Der begrenzende Faktor wird der Raum zwischen der Bühne und den Zielen sein. Möglicherweise sind Änderungen an der Phase erforderlich, um diese Einrichtung durchzuführen.
2. Befestigen Sie die Operations-/Bildgebungsplattform auf einem speziell angefertigten Tisch, der sich neben der Basis des Mikroskops befindet. Hinweis: Die Plattform wird mit einem Laborheber hergestellt, um eine vertikale Bewegung der chirurgischen/bildgebenden Plattform unter dem Objektiv zu ermöglichen. Der Laborheber wird an einer Platte montiert, die an vier zylindrischen Polen befestigt ist. (Siehe Abbildung 2).
3. Positionieren Sie den Objektivwechselrichter mit einem 20X-Objektiv über dem Schädelfenster. Verwenden Sie eine externe Lichtquelle, um das Schädelfenster zu finden, indem Sie durch die Okulare des Mikroskops schauen und das Objektiv im Bildgebungsbereich positionieren. Hinweis: Der Bildgebungsbereich wird durch das Vorhandensein des Gefäßsystems gekennzeichnet.
4. Verwenden Sie für wasserbasierte Objektive künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH₂PO₄; 200 mM NaHCO₃; 30 mM Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure [HEPES]; und 100 mM Glukose) als Medium, da während der Bildgebung möglicherweise ein Leck in die Schädelhöhle auftritt (Abbildung 3).

4. Zubereitung, Verabreichung und Induktion des Schlaganfalls in Rose Bengal

1. Bereiten Sie eine frische 20 mg/ml-Lösung von Rose Bengal in aCSF vor; Vor der Verabreichung filtrieren und sterilisieren. Verwenden oder lagern Sie die Rose Bengal nicht wieder, nachdem sie gemischt wurde. Erstellen Sie für jedes Experiment eine neue Lösung.
2. Geben Sie eine 0,1 ml Schwanzveneninjektion von Rose Bengal, während Sie das Schädelfenster mit einem 561-nm-Laser scannen, um eine angemessene Injektion der Lösung sicherzustellen. Hinweis: Rose Bengal wird innerhalb von 5 Sekunden nach der Injektion in das Gefäßsystem des Gehirns sichtbar gemacht. Das gesamte Gefäß sollte mit Rose Bengal gefüllt sein.
3. Nach adäquater Injektion von Rose Bengal Farbstoff wählen Sie ein geeignetes Gefäß für die Thrombose basierend auf dem Gefäßdurchmesser (40-80 μm), um die Reproduzierbarkeit eines bestimmten Läsionsvolumens zu gewährleisten. Unterscheiden Sie zwischen Arterien und Venen, indem Sie sich die Richtung des Blutflusses ansehen: Arterien bewegen sich von Gefäßen mit größerem Durchmesser zu Gefäßen mit kleinerem Durchmesser, Venen bewegen sich von Gefäßen mit kleinerem Durchmesser zu Gefäßen mit größerem Durchmesser. Dies kann leicht durch Visualisierung erreicht werden, sobald Rose Bengal injiziert wurde.
4. Ändern Sie die Mikroskopeinstellung wie folgt:
   1. Erhöhen Sie die Verweilzeit. Hinweis: Dies hängt vom verwendeten Mikroskopsystem ab.
   2. Erhöhen Sie die Laserleistung auf 100 %.
   3. Erfassen Sie Zeitsequenzbilder mit 1 Bild/Sekunde unter Verwendung der maximalen Scangeschwindigkeit.
5. Scannen Sie die Maus, bis sich ein stabiles Gerinnsel im Gefäß gebildet hat. Hinweis: Dies wird in der Regel innerhalb von 5 Minuten nach kontinuierlichem Scannen erreicht (siehe Abbildung 4).
6. Nach der Induktion der Gerinnselbildung mit Rose Bengal nehmen Sie die Maus aus dem Bildgebungsbereich zurück zum Präpariermikroskop. Entfernen Sie vorsichtig den Edelstahlring vom Schädel. Untersuche das Schädelfenster auf Blutungen. Wenn Blutungen auftreten, beenden Sie den Versuch.
7. Verwenden Sie eine monofile Naht 6.0, um den Schnitt über dem Schädel zu schließen. Tragen Sie eine antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie auf, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Sie Buprenex (0,05 mg/kg) drei Tage lang alle 12 Stunden subkutan zur Schmerzbehandlung.
8. Bringen Sie die Maus nach der Entnahme aus der Narkose in eine Aufwachkammer zurück, bis sie vollständig wach ist und sich frei bewegt.
9. Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig zurück, um sie zu einem späteren Zeitpunkt weiter zu untersuchen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Edelstahlring. Es werden drei Ansichten (oben, von der Seite und von unten) des Edelstahlringhalters gezeigt, der auf den Schädel der Maus aufgebracht wird, um ihn an der stereotaktischen Halterung zu befestigen.

Materialien