Dieses Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Injektion einer Virussuspension in die Spinalganglien (DRGs) und zur Induktion einer kontrollierten axonalen Verletzung über einen dorsalen Wurzelcrush bei einer anästhesierten Ratte. Das Protokoll umfasst die Freilegung der DRGs, die Verabreichung eines wachstumsfördernden viralen Vektors zur Erleichterung der axonalen Regeneration und die Durchtrennung axonaler Verbindungen zum Rückenmark, um sensorische Nervenverletzungen und -regeneration zu modellieren.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Modellierung der sensorischen Axonregeneration bei einer Ratte mittels Injektion des Spinalganglion und Dorsalwurzelquetschverletzung
1.2K Aufrufe
⸱
28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Injektion von DRG und Durchführung einer Dorsalwurzelquetschverletzung
HINWEIS: Dies ist eine äußerst heikle Operation. Es ist ratsam, zuerst an einigen toten Tieren zu üben, um sich mit der Anatomie vertraut zu machen, bevor man zur Operation an lebenden Tieren übergeht.
- Lokalisieren Sie die markanten C2- und T2-Dornfortsätze über der Haut. Machen Sie einen Hautschnitt zwischen den Dornfortsätzen C2 und T2 mit einer Skalpellklinge Nr. 10 (sobald die Haut geöffnet ist, sollte auf der ersten Muskelschicht eine weiße, faserige Mittellinie sichtbar sein; die erste Muskelschicht hat eine "geleeartige" Textur).
- Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen ähnlich großen Schnitt in der ersten Muskelschicht entlang der weißen Mittellinie. Gehen Sie nicht über den markanten T2-Dornfortsatz hinaus, da sich in der Nähe ein großer arterieller Ast von der absteigenden Aorta befindet.
HINWEIS: Starke Blutungen können ab diesem Schritt überall auftreten. Stoppen Sie immer die Blutung und entfernen Sie das Blut, indem Sie sterilisierte Wattestäbchen oder chirurgisch resorbierbare Schwämme verwenden, um jederzeit eine klare Visualisierung zu ermöglichen. Wenn Sie das Verfahren "blind" durchführen, kann dies zu unerwünschten Schäden am Rückenmark, DRG oder der Rückenwurzel führen, was später zu unerwarteten Nebenwirkungen beim Tier führt. - Ziehen Sie die erste Muskelschicht mit zwei Retraktoren zurück, von denen einer rostral und einer kaudal platziert ist. Die zweite Muskelschicht mit einem gestreiften Aussehen sollte sichtbar sein.
- Lokalisieren Sie die Mittellinie der zweiten Muskelschicht (wo zwei Längsmuskeln zu sehen sind, die durch ein dünnes, membranöses Gewebe verbunden sind). Präparieren Sie das membranöse Gewebe mit einer Mikroschere, um die beiden Längsmuskeln zu trennen. Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Verwendung einer Skalpellklinge, da dies zu unnötigen Muskelschäden und Blutungen führen kann.
- Passen Sie die Retraktoren entsprechend an, um die dritte Schicht dünner Muskeln, die die Wirbelsäule bedeckt, freizulegen. Die Dornfortsätze können durch leichtes Berühren der dritten Muskelschicht mit einer Zange ertastet werden.
- Machen Sie mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt an der dritten Muskelschicht und kratzen Sie den Muskel vorsichtig mit einer Kürette oder einem Skalpell seitlich vom Knochen ab, um die Wirbel deutlich freizulegen. Schneiden Sie bei Bedarf einen Teil des Muskels oder der Sehne ab, um die Laminektomie zu erleichtern.
- Um die linken DRGs C5 - C8 freizulegen, führen Sie eine linke Hemi-Laminektomie an den Wirbeln C4 - T1 durch, indem Sie vorsichtig einen Teil der Lamina und des Stiels mit einem Paar feiner Rongeure entfernen. Das DRG befindet sich in der Nähe des Foramen transversum der Wirbel.
HINWEIS: C3 - C7 Wirbel haben keinen ausgeprägten Dornfortsatz. Der C5 DRG befindet sich zwischen den Wirbeln C4 und C5, der C6 DRG zwischen den Wirbeln C5 und C6 usw., während der C8 DRG zwischen den Wirbeln C7 und T1 liegt. Es gibt keinen C8-Wirbel, obwohl ein C8-DRG und ein C8-Rückenmarkssegment vorhanden sind. - Sobald genügend DRG für die Injektion freigelegt wurde, bereiten Sie die Spritze vor, indem Sie die mit Viren gefüllte Mikroliterspritze mit einer speziell angefertigten stumpfen 33-Gauge-Nadel auf den stereotaktischen Spritzenhalter legen. Verwenden Sie vor der Injektion eine abgeschrägte 30-Gauge-Nadel, um eine kleine oberflächliche Öffnung an jedem der anvisierten DRG zu machen, um das Einführen der Injektionsnadel zu erleichtern.
- Führen Sie die 33-Gauge-Nadel in die Mitte des DRG ein, indem Sie die Knöpfe leicht drehen, um die stereotaktischen Koordinaten einzustellen. Führen Sie die Nadel nicht zu stark ein, da dies dazu führen kann, dass Flüssigkeit aus der ventralen Seite des DRG austritt. Sollte es zu einer Leckage kommen, passen Sie die Position der Nadel sofort an.
HINWEIS: Die numerischen stereotaktischen Koordinaten werden nicht verwendet; Es ist jedoch hilfreich, den Rahmen zu verwenden, um die Nadel für die Injektion zu halten. - Injizieren Sie 1 μl des Virus mit einer Infusionsspritzenpumpe mit 0,2 μl/min in jedes DRG. Warten Sie weitere drei Minuten, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Während der Injektion ändert sich das DRG langsam, wenn die Viruslösung einen farbigen Farbstoff enthält.
- Um eine gleichzeitige Verletzung des dorsalen Wurzelquetsches C5 - C8 durchzuführen, zerquetschen Sie jede Wurzel dreimal für jeweils 10 s mit einer Pinzette mit feiner Spitze (Bonn Micro), wobei Sie die Enden der Pinzette vollständig gegenüberliegen; An der Quetschstelle sollte eine weiße Linie im Gewebe erscheinen. Gehen Sie mit der Pinzette nicht tiefer als erforderlich, da dies zu einer Schädigung der ventralen Wurzel führen kann.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fast Green FCF dye | Sigma-Aldrich | F7258< | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | FST 12502-12 | |
| Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup | Fine Science Tools< | ||
| Bonn Micro Pinzette | Fine Science Tools | FST 11083-07< | |
| Gewebetrennschere | Fine Science Tools | FST 14072-10 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | FST 14058-11 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | FST 11018-12 | |
| Goldstein Retractor | Fine Science Tools | FST 17003-03 | |
| Vannas Federschere (gerade) | Fine Science Tools | FST 15018-10 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Ethicon | 1972< | |
| Mikroliter-Spritze RN701 (10 μl) | Hamilton | 80330 | |
| Maßgeschneiderte abnehmbare Nadel (für DRG-Injektion) | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 38 mm, point style 3 |
| UltraMicroPump mit SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 |
