Beurteilung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke in einem Rattenmodell mit laserinduzierter Hirnverletzung

Zusammenfassung

Quelle: Kuts, R. et al. Laserinduzierte Hirnverletzung im motorischen Kortex von Ratten. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Beurteilung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) nach einer laserinduzierten Hirnverletzung bei Ratten. Ein Tracking-Farbstoff wird in die Schwanzvene injiziert, so dass er zum Gehirn zirkulieren und durch die geschädigte BHS in das Gewebe gelangen kann. Das Gehirn wird dann extrahiert und verarbeitet, um den Farbstoff freizusetzen. Die Fluoreszenzintensität des Farbstoffs wird gemessen, um das Ausmaß der laserinduzierten BHS-Schädigung zu quantifizieren.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Laserinduzierte Hirnverletzung experimentelles Verfahren

1. Ordnen Sie 20 Ratten einer Gruppe zu, die als Lasergruppe markiert ist, und 20 Ratten einer anderen Kontrollgruppe (scheinoperiert).
2. Setzen Sie die Lasergruppe Ratten auf folgende Weise einer Laserbestrahlung bei 50J x 10 Punkten aus:
   1. Betäuben Sie Ratten mit einer Mischung aus 2% Isofluran in Sauerstoff, um eine spontane Beatmung zu ermöglichen. Überprüfen Sie, ob die Narkosetiefe ausreichend ist, indem Sie den Schwanz mit einer Pinzette einklemmen, um das Fehlen des Entzugsreflexes zu überprüfen.
   2. Halten Sie die Körperkerntemperatur der Ratte während des gesamten experimentellen Verfahrens auf 37 °C mit einem rektalen temperaturgeregelten Heizkissen.
   3. Entfernen Sie lokale Haare mit einem Rasierer und desinfizieren Sie sie mit 70% Alkohol und 0,5% Chlorhexidingluconat. Wiederholen Sie den Desinfektionsschritt noch zwei weitere Male.
      HINWEIS: Die Größe des chirurgischen Schnitts sollte ca. 3 cm betragen. Entfernen Sie Haare mindestens 2 cm um den Schnittbereich herum.
   4. Setze die Ratte auf einen stereotaktischen Kopfhalter in Bauchlage und mache einen 3 cm langen Schnitt, um die Kopfhaut seitlich zu reflektieren und den Bereich zwischen Bregma und Lambda freizulegen.
   5. Halten Sie die Anästhesie durch den Nasenkegel aufrecht.
   6. Verwenden Sie einen Neodym-dotierten Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd-YAG) (Spitzenwellenlänge 1064 nm), um 50J x 10 Punkte, mit 1 s Pulsdauer, auf den exponierten Bereich des Schädels über der rechten Hemisphäre zu verabreichen.
   7. Stellen Sie sicher, dass der lasererzeugende Teil des Geräts in einem Abstand von 2 mm zum belichteten Bereich ist, um einen Laserstrahl zu erzeugen. 50J x 10 Punkte wurden nach sorgfältiger Abwägung verschiedener Energie-/Oberflächenkombinationen ausgewählt. Diese Kombination ist effizient und führt nach der Verabreichung für weniger als eine Sekunde nicht zu einer Knochenzerstörung des Schädels.
      HINWEIS: 2 mm ist der Abstand zwischen dem Anschluss des Laserstrahls (von dem optischen Kabel, durch das er geführt wird) und dem Schädelknochen. Falls eine Fokussierlinse verwendet wird, sollte der Abstand unter Berücksichtigung des Neigungswinkels der Linse berechnet werden, um den Strahl in den gewünschten Schadensbereich zu fokussieren. Sorgen Sie für die richtige Sicherheit bei der Verwendung eines Lasergeräts, einschließlich einer angemessenen Schulung und eines Augenschutzes.
   8. Entferne die Ratte aus dem Gerät und verschließe die Kopfhaut mit 3-0 chirurgischen Seidennähten.
   9. Beenden Sie die Anästhesie und bringen Sie die Ratte zur Genesung in ihren Käfig zurück. 0,1 ml 0,25% Bupivacain lokal verabreichen, um die postoperativen Schmerzen unmittelbar nach der Operation zu reduzieren.
      HINWEIS: Die gesamte Prozedur sollte weniger als 5 Minuten dauern, wenn sie korrekt durchgeführt wird.
3. Beobachte die Ratte auf Anzeichen von Stress während der Genesung nach der Anästhesie. Vor Beendigung der Narkose ist 0,01 mg/kg intramuskuläres Buprenorphin zur postoperativen Analgesie zu verabreichen und die wiederholten Dosen alle 12 Stunden für mindestens 48 Stunden fortzusetzen.
4. Setze Kontrollratten den gleichen Bedingungen aus, ohne sie dem Laser auszusetzen.

2. Neurologischer Schweregrad (NSS)

1. Bewerten Sie den neurologischen Schweregrad 24 Stunden nach der laserinduzierten Hirnverletzung mit einem 43-Punkte-Wert. Testen Sie die Tiere auf neurologische Defizite, Verhaltensstörungen, Beam-Balancing-Aufgaben und Reflexe und vergeben Sie höhere Noten für schwerere Behinderungen.

3. Bewertung von Hirnverletzungen

1. Bestimmung des Ausmaßes einer Verletzung der Blut-Hirn-Schranke (BHS)
   HINWEIS: Beurteilen Sie den BHS-Bruch 24 Stunden nach der laserinduzierten Hirnverletzung wie folgt:
   1. Verabreichen Sie Ratten intravenös 2% Evans Blue gemischt mit 4 ml/kg Kochsalzlösung über die kanülierte Schwanzvene und lassen Sie die Lösung 1 h lang zirkulieren.
   2. Euthanasieren Sie Ratten, indem Sie sie 24 Stunden nach der letzten NSS 20% Sauerstoff und 80% CO₂ (durch Inspiration) aussetzen.
   3. Ernten Sie den intravaskulär lokalisierten Farbstoff wie folgt:
      1. Öffnen Sie die Brust der Ratten mit chirurgischen Pinzetten und chirurgischen Scheren.
      2. Perfundieren Sie die Tiere mit gekühlter 0,9%iger Kochsalzlösung über den linken Ventrikel mit 110 mmHg, bis Sie eine farblose Perfusionsflüssigkeit aus dem rechten Vorhof erhalten.
   4. Entnehmen Sie die Gehirne und schneiden Sie sie rostro-kaudal in 2 mm dicke Scheiben.
   5. Trennen Sie die Schnitte der linken Gehirnhälfte von den rechten Teilen, um verletzte und nicht verletzte Hemisphären getrennt zu bewerten.
   6. Wiegen, mit Mörser und Stößel homogenisieren und dann das Gehirngewebe 24 Stunden lang in 50% Trichloressigsäure inkubieren.
   7. Zentrifugieren Sie die homogenisierten Gehirnscheiben bei 10.000 × g für 20 min.
   8. Mischen Sie 1 mL des Überstands aus dem zentrifugierten Gehirn mit 1,5 mL 96% Ethanol im Verhältnis 1:3 und beurteilen Sie den Bruch der Blut-Hirn-Schranke mit einem Fluoreszenzdetektor bei 620 nm Anregungswellenlänge (10 nm Bandbreite) und 680 nm Emissionswellenlänge (10 nm Bandbreite).
      HINWEIS: Beide Gruppen von Ratten durchlaufen das gleiche Protokoll zur Bestimmung des BHS-Abbaus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
50% Trichloressigsäure	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Gehirn & Gewebematrizen	SIGMA - ALDRICH	15013
Kanüle Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Zentrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Kompakte Analysenwaagen	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digitale Waage	SIGMA - ALDRICH	Rs 4.000
Präparierschere	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Entzündliche Flüssigkeit
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Fluoreszenzdetektor	Tecan, Männedorf Schweiz	Modell Infinite 200 PRO Multimode Reader
Heizung mit	Thermometer Heatingpad-1	Modell: HEATINGPAD-1/2
Infusionsmanschette	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 Mikroskop	Olympus
Petrischalen	SIGMA - ALDRICH	P5606
Skalpellklingen 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat) Lasermaschine	Laser Industries Ltd
Stereotaktischer Kopfhalter	KOPF	900LS
Sterile Spritze 2 ml	Braun	4606027V
Spritzennadel 27 G	Braun	305620