1. Aussaat von Endothelzellen
- Beziehen Sie Primärkulturen von RBMECs von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten (oder beziehen Sie sie kommerziell).
- Kultivieren Sie RBMECs in 100 cm mit Fibronektin (50 μg/ml) beschichteten Petrischalen unter Verwendung des Endothelzellwachstumsmediums des Rattengehirns. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Konfluenz erreicht ist.
- Bei Erreichen einer Konfluenz von 80-90 % waschen Sie die Zellen vorsichtig in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Schwenken. Die Zellen werden dann abgelöst, indem sie 1 ml warmer 0,25%iger Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung ausgesetzt werden, die auf 37 °C äquilibriert ist.
- Inkubieren Sie die Zellen 2-5 Minuten lang bei 37 °C, bis sich die Zellen gelöst und dispergiert haben.
HINWEIS: Klopfen Sie auf die Kulturschale, um die Zellen zu lösen. Betrachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die vollständige Ablösung der Zellen von der Oberfläche der Schale zu bestätigen. - Geben Sie 5 ml vollständiges Medium in die Petrischale, um das Trypsin zu neutralisieren. Das Medium mit den abgelösten Zellen wird pipettiert und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
- Zentrifugieren Sie das Medium, das Endothelzellen enthält, bei 220 x g für 5 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und bewahren Sie die pellethaltigen Zellen auf. Suspendieren Sie das Pellet in 3-5 ml frisches Endothelzellwachstumsmedium des Rattengehirns, indem Sie es vorsichtig mit einer Pipette auf und ab mischen. Die Zellen werden dann mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer gezählt.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorbeschichtetes 8-Well-Sterilkammer-Objektträgersystem mit Fibronektin (50 μg/ml), 0,7 cm2/Well mit einer Aussaatdichte zwischen 10.000 und 15.000 Zellen pro Well. Vergrößern Sie die Zellen bei 37 °C, bis die Konfluenz erreicht ist
NOTE: Für die Durchführung von Western Blots oder anderen Experimenten können die Zellen je nach Bedarf in 10 cm Zellkulturschalen oder speziellen Schalen gezüchtet werden.
2. Sauerstoff- und Glukoseentzug-Reoxygenierung (OGD-R) In vitro Modell
- Verwenden Sie das Hypoxie-Zellkultursystem, um die Auswirkungen von OGD-R auf RBMECs zu untersuchen (siehe Abbildung 1). Richten Sie das Hypoxie-Zellkultursystem vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren
Sie es.- Nehmen Sie die Objektträger der konfluenten Kammer (Schritt 1.8) aus dem 37 °C heißen Inkubator. Ersetzen Sie das komplette Medium in der Kammerfolie durch sauerstoffarmes, glukosefreies Dulbecco's Medium (DMEM) und legen Sie es in die Hypoxiekammer mit 95%, N2 und 5% CO2 für 2 Stunden bei 37 °C, um den OGD-Zustand darzustellen.
- Verschieben Sie die Zellen zurück in den Inkubator mit 95% O2, 5% CO2 bei 37 °C und mit frischer Endothelzelle des Rattengehirns versorgt, mit vollständigem Medium versehen und weitere 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Dieser Schritt stellt eine Reoxygenierungssituation dar. - Verwenden Sie die Kammer-Objektträger für die Immunfluoreszenz-Lokalisierung und die Rhodamin-Phalloidin-Markierung (siehe Abschnitt 3).
3. Immunfluoreszenz-Lokalisation von Zonula occludens-1 (ZO-1) und filamentösem Aktin (f-actin) Beschriftung mit Rhodamin Phalloidin
- Belichtung der Objektträger mit RBMEC-Monolayern 100 μl opti-MEM/reduziertes Serummedium/Vertiefung für 1 Stunde. Waschen Sie die Objektträger der Kammer 3 Mal in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0-7,2).
- Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 100 μl 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,0-7,2) und waschen Sie die Objektträger weitere 3 Male in PBS (pH 7,0-7,2).
- Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 μl 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) für weitere 15 Minuten. Eine Stunde lang mit 100 μl 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockieren. Nach diesem Schritt färben/beschriften Sie Zellen entweder für ZO-1 oder f-actin.
- Für die Immunfluoreszenzfärbung inkubieren Sie die Zellen mit einem Anti-Kaninchen-Primärantikörper gegen ZO-1 in 1:150, hergestellt in 2% BSA-PBS für über Nacht (O/N) bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen 3 Mal in PBS (pH 7,0-7,2). Inkubieren Sie mit 100 μl Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markiertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT).
- Für die Rhodamin-Phalloidin-Markierung setzen Sie die Zellen nach der Blockierung 100 μl Rhodamin-Phalloidin in einer Verdünnung von 1:50 aus, hergestellt in 2% BSA-PBS, für 20 Minuten.
- Waschen Sie die Zellen von der Immunfluoreszenzfärbung und der Rhodamin-Phalloidin-Markierung bei PBS (pH 7,0-7,2). Montieren Sie die Kammern mit Einbettmedien, die ein Anti-Fade-Reagenz mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthalten.
- Visualisieren Sie die Zellen mit einer 60-fachen Wasserimmersionslinse, und die Zellen werden in einer einzigen optischen Ebene unter einem konfokalen Mikroskop gescannt.