Fluoreszenzlokalisation von Tight Junction Proteinen und Stressfasern in Endothelzellen

Zusammenfassung

Quelle: Alluri, H., et al. Sauerstoff-Glukose-Entzug und Reoxygenierung als In-vitro-Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranken-Dysfunktion. J. Vis. Exp. (2015).

Das Video zeigt die fluoreszierende Lokalisierung von Tight-Junction-Proteinen und Stressfasern in mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) des Rattengehirns. In der gestressten Monoschicht werden fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet, um die Tight-Junction-Proteine zu markieren, während Fluorophor-markiertes Phalloidin die Stressfasern markiert. Die markierten Moleküle werden dann durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht.

Protokoll

1. Aussaat von Endothelzellen

1. Beziehen Sie Primärkulturen von RBMECs von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten (oder beziehen Sie sie kommerziell).
2. Kultivieren Sie RBMECs in 100 cm mit Fibronektin (50 μg/ml) beschichteten Petrischalen unter Verwendung des Endothelzellwachstumsmediums des Rattengehirns. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Konfluenz erreicht ist.
3. Bei Erreichen einer Konfluenz von 80-90 % waschen Sie die Zellen vorsichtig in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Schwenken. Die Zellen werden dann abgelöst, indem sie 1 ml warmer 0,25%iger Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung ausgesetzt werden, die auf 37 °C äquilibriert ist.
4. Inkubieren Sie die Zellen 2-5 Minuten lang bei 37 °C, bis sich die Zellen gelöst und dispergiert haben.
   HINWEIS: Klopfen Sie auf die Kulturschale, um die Zellen zu lösen. Betrachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die vollständige Ablösung der Zellen von der Oberfläche der Schale zu bestätigen.
5. Geben Sie 5 ml vollständiges Medium in die Petrischale, um das Trypsin zu neutralisieren. Das Medium mit den abgelösten Zellen wird pipettiert und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
6. Zentrifugieren Sie das Medium, das Endothelzellen enthält, bei 220 x g für 5 min.
7. Aspirieren Sie den Überstand und bewahren Sie die pellethaltigen Zellen auf. Suspendieren Sie das Pellet in 3-5 ml frisches Endothelzellwachstumsmedium des Rattengehirns, indem Sie es vorsichtig mit einer Pipette auf und ab mischen. Die Zellen werden dann mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer gezählt.
8. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorbeschichtetes 8-Well-Sterilkammer-Objektträgersystem mit Fibronektin (50 μg/ml), 0,7 cm²/Well mit einer Aussaatdichte zwischen 10.000 und 15.000 Zellen pro Well. Vergrößern Sie die Zellen bei 37 °C, bis die Konfluenz erreicht ist
   NOTE: Für die Durchführung von Western Blots oder anderen Experimenten können die Zellen je nach Bedarf in 10 cm Zellkulturschalen oder speziellen Schalen gezüchtet werden.

2. Sauerstoff- und Glukoseentzug-Reoxygenierung (OGD-R) In vitro Modell

1. Verwenden Sie das Hypoxie-Zellkultursystem, um die Auswirkungen von OGD-R auf RBMECs zu untersuchen (siehe Abbildung 1). Richten Sie das Hypoxie-Zellkultursystem vor Beginn des Experiments gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren
Sie es.
2. Nehmen Sie die Objektträger der konfluenten Kammer (Schritt 1.8) aus dem 37 °C heißen Inkubator. Ersetzen Sie das komplette Medium in der Kammerfolie durch sauerstoffarmes, glukosefreies Dulbecco's Medium (DMEM) und legen Sie es in die Hypoxiekammer mit 95%, N₂ und 5% CO₂ für 2 Stunden bei 37 °C, um den OGD-Zustand darzustellen.
3. Verschieben Sie die Zellen zurück in den Inkubator mit 95% O₂, 5% CO₂ bei 37 °C und mit frischer Endothelzelle des Rattengehirns versorgt, mit vollständigem Medium versehen und weitere 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Dieser Schritt stellt eine Reoxygenierungssituation dar.
4. Verwenden Sie die Kammer-Objektträger für die Immunfluoreszenz-Lokalisierung und die Rhodamin-Phalloidin-Markierung (siehe Abschnitt 3).

3. Immunfluoreszenz-Lokalisation von Zonula occludens-1 (ZO-1) und filamentösem Aktin (f-actin) Beschriftung mit Rhodamin Phalloidin

1. Belichtung der Objektträger mit RBMEC-Monolayern 100 μl opti-MEM/reduziertes Serummedium/Vertiefung für 1 Stunde. Waschen Sie die Objektträger der Kammer 3 Mal in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0-7,2).
2. Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 100 μl 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,0-7,2) und waschen Sie die Objektträger weitere 3 Male in PBS (pH 7,0-7,2).
3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 μl 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) für weitere 15 Minuten. Eine Stunde lang mit 100 μl 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS blockieren. Nach diesem Schritt färben/beschriften Sie Zellen entweder für ZO-1 oder f-actin.
   1. Für die Immunfluoreszenzfärbung inkubieren Sie die Zellen mit einem Anti-Kaninchen-Primärantikörper gegen ZO-1 in 1:150, hergestellt in 2% BSA-PBS für über Nacht (O/N) bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen 3 Mal in PBS (pH 7,0-7,2). Inkubieren Sie mit 100 μl Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markiertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT).
   2. Für die Rhodamin-Phalloidin-Markierung setzen Sie die Zellen nach der Blockierung 100 μl Rhodamin-Phalloidin in einer Verdünnung von 1:50 aus, hergestellt in 2% BSA-PBS, für 20 Minuten.
   3. Waschen Sie die Zellen von der Immunfluoreszenzfärbung und der Rhodamin-Phalloidin-Markierung bei PBS (pH 7,0-7,2). Montieren Sie die Kammern mit Einbettmedien, die ein Anti-Fade-Reagenz mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthalten.
4. Visualisieren Sie die Zellen mit einer 60-fachen Wasserimmersionslinse, und die Zellen werden in einer einzigen optischen Ebene unter einem konfokalen Mikroskop gescannt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Proox model 110	Biospherix	model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamin Phalloidin	Life Technologies	R415
ZO-1 Kaninchen Polyklonaler Antikörper	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well steril, Glasobjektträger	Thermo scientific	177402
FITC-getaggt Anti-Kaninchen-Sekundär Antikörper	Santa Cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Jedes andere verfügbare PBS kann verwendet werden