Dieses Video zeigt die Aktivierung und Migration von neuralen Stammzellen (NSCs) in einem Modell für Rückenmarksverletzungen der Maus. Um das Rückenmark freizulegen, wird einer anästhesierten Maus ein Wirbel aus dem Brustbereich der Wirbelsäule entnommen. In der weißen Substanz des Rückenmarks wird dann mit einer gebogenen Nadel eine oberflächliche Verletzung erzeugt, die den Zentralkanal schont. Nach der Verletzung werden die NSCs, die den Kanal umgeben, aktiviert und wandern zur Verletzungsstelle, um die Gewebereparatur zu unterstützen.
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Methodenartikel
Ein Modell für minimale Rückenmarksverletzungen zur Untersuchung der Aktivierung und Migration neuraler Stammzellen
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Minimale Operation bei Rückenmarksverletzungen
HINWEIS: Stellen Sie vor der Operation sicher, dass alle chirurgischen Instrumente und Materialien mit geeigneten Methoden sterilisiert werden (Abbildung 1A).
- Baue einen thorakalen Stützbogen, indem du 4–5 Quadrate Gaze aufrollst und sie in der Mitte zusammenklebt, um eine feste Rolle Gaze zu erhalten.
- Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer und leiten Sie die Anästhesie mit 5% Isofluran ein. Vergewissern Sie sich, dass kein Zehenquetschreflex vorhanden ist, bevor Sie fortfahren, sowie während des gesamten Eingriffs. Da die Operation bis zu 30 Minuten dauern kann, optimieren Sie die minimale Isofluran-Exposition (5 Minuten bei 5 % und die verbleibende Zeit bei 2–3 %).
- Übertragen Sie die Maus in einen Nasenkonus, der mit einer Erhaltungsdosis von 2–3 % Isofluran an das Anästhesiegerät angeschlossen ist. Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um das Fell vom Rücken des Tieres von der Mitte des Rückens bis zum Hals/den Ohren zu entfernen, um eine breite rechteckige Hautfläche für die Operation freizulegen.
- Übertragen Sie die Maus auf ein stereotaktisches Instrument, indem Sie ihre Nase in den angebrachten Nasenkonus stecken und den Schädel mit Ohrstangen stabilisieren. Halten Sie den Isoflurangehalt während der Platzierung der Ohrbügel bei 5 % und senken Sie den Rücken auf 2–3 %, sobald die Maus in der stereotaktischen Vorrichtung gesichert ist.
- Präoperative schmerzstillende Medikamente intraperitoneal verabreichen – Meloxicam (2,0 mg/kg). Tragen Sie großzügig Augenbefeuchtung auf die geöffneten Mausaugen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut unter Narkose zu verhindern.
- Platzieren Sie den thorakalen Stützbogen unter dem Mäusebauch, während Sie den Mauskörper und die Wirbelsäule durch leichtes Ziehen an der Basis des Schwanzes begradigen. Verwenden Sie Labor-Beschriftungsband, um den Schwanz und alle ausgestreckten Gliedmaßen in einer sternförmigen Position zu sichern. Sobald er fest sitzt, schieben Sie den thorakalen Stützbogen rostral vom Mausbauch in Richtung des oberen Thorax – um die Brustwirbelsäule abzustützen (Abbildung 1B).
- Bereiten Sie ein steriles Operationsfeld vor, indem Sie die in Schritt 1.3 vorbereitete fellgeschorene Hautpartie mit 70 % Ethanol und anschließend mit Povidon-Jod desinfizieren. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal. Tragen Sie ein steriles OP-Tuch auf, um ein breites steriles Feld zu erhalten.
- Machen Sie mit einer Skalpellklinge #10 einen vertikalen Schnitt parallel zur Längsachse des Tieres von der Mitte beider Schulterblätter bis zur Krümmung der Brustwirbelsäule. Ziehen Sie die Haut zurück, um das Weichgewebe und die Kontur der Wirbelsäule freizulegen (Abbildung 1C).
- Identifizieren Sie den unteren Rand des suprascapularen Fettpolsters (dies grenzt die Wirbelebene T4/5 ab). Schneiden Sie mit der gleichen Klinge #10 vorsichtig, aber mit Kraft entlang beider Seiten des Wirbelknochens T5–T8/9, um die Rückenmuskelsehnen von der Säule zu lösen.
- Führen Sie die Zähne der Retraktoren in die Schnittstellen auf beiden Seiten der Wirbelsäule ein. Passen Sie die Belichtung an, indem Sie die Retraktoren erweitern, um die Wirbelsäule ausreichend anzuheben, ohne die eingezogenen Muskelschichten zu stark zu belasten (Abbildung 1D).
- Reinigen Sie unter dem Operationsmikroskop vorsichtig den Restmuskel und anderes Weichgewebe über der Wirbelsäule, um den Wirbelknochen freizulegen (Abbildung 1E). Identifizieren Sie die Wirbel, die entfernt werden sollen, indem Sie den Dornfortsatz der Wirbel mit einer Zahnzange umklammern und leicht auf und ab bewegen.
HINWEIS: Dies sollte die Identifizierung von Zwischenwirbelgelenken ermöglichen und die kleinen Öffnungen (Foramina intervertebralis) unter den interessierenden Wirbeln freilegen. - Führen Sie einen Kopf der gebogenen stumpfen Schere in beide Seiten des freiliegenden Foramen intervertebralis, kaudal der auszuschneidenden Wirbellamina, ein und schneiden Sie die verbindenden Zwischenwirbelgelenke beidseitig ab.
- Hebe die Lamina nach oben und schneide den oberen Ansatz der Lamina ab, um den Knochen zu isolieren und zu entfernen.
HINWEIS: Dadurch wird der intakte Duralsack freigelegt, der das Rückenmark enthält (Abbildung 1F). Es kann zu übermäßigen Blutungen kommen, die durch Auftragen von vorgeschnittener 1 cm x 1 cm Gaze auf die betroffenen Stellen und/oder Waschen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) kontrolliert werden können. - Mit der Vena dorsal medial als Orientierungspunkt wird ein um 45° gebogener Schaft einer 30 G Nadelspitze (mit Nadelschräge nach oben) in die dorsolaterale Fläche des Rückenmarks (ca. 1 mm tief) in einem Abstand von ca. 0,5 mm lateral zu beiden Seiten der Mittellinie eingeführt.
- Bewegen Sie die Nadel ~2 mm von kaudal nach rostral (parallel zur Mittellinie), so dass die gesamte Länge der Nadelschräge in die Schnur eingeführt wird. Entfernen Sie die Nadel, indem Sie über den Eintrittspfad zurückverfolgen (Abbildung 1G).
HINWEIS: Es sollte keine Blutung geben, aber bei diesem Schritt kann eine Schwellung des Wirbelsäulengewebes zu sehen sein. - Um die Wunde zu schließen, entfernen Sie den Retraktor und nähen Sie die Rückenmuskulatur auf beiden Seiten der Verletzung in der Mittellinie mit einer resorbierbaren Naht 6-0 zusammen. Verwenden Sie eine sterile 4-0-Seidennaht, um die darüber liegende Haut anschließend zu verschließen.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Chirurgischer Eingriff. (A) Das Layout von allem, was benötigt wird, nummeriert als Referenz. (B) Ein Bild der Maus in einem stereotaktischen Gerät mit einem aufgerichteten Körper, Wirbelsäule und Gliedmaßen, die ausgebreitet und zusammen mit einem darunter platzierten thorakalen Stützbogen geklebt sind. (C) Ein Bild der Maus mit einem ve...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Federschere (gebogen) | Fine Science Tools | 15370-50 | Bei Bestellung anpassen, um stumpfe Spitzen |
| Graefe Pinzette (gerade, 1x2 Zähne) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra feine Graefe-Pinzette (gebogen, gezackt) | Fine Science Tools | 11152-10< | |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Oder eine andere zum Nähen geeignete |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Oder eine andere geeignete |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | oder eine andere geeignete |
| Stereotaxic instrument< | 51500< | ||
| Meloxicam | oder eine von der Tierpflegeeinrichtung | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | oder ein anderer geeigneter |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | oder ein anderer für die Anästhesie geeigneter < |
| amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS< | ||
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25G Needles | Becton Dickin style='width:332pt;'>305122 | Für Drogeninjektionen | |
| 1mL Spritzen | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injektions |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881< | |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889< | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000< |
