Dieses Video zeigt die Präparation von aldehydfixiertem Hirngewebe von nicht-menschlichen Primaten mittels Pre-Embedding-Immunhistochemie für die Elektronenmikroskopie. Es werden die Schritte zur Immunmarkierung eines bestimmten neuronalen Proteins beschrieben, gefolgt von einer Peroxidasereaktion, die einen farbigen Niederschlag erzeugt, der die Visualisierung des Zielproteins in der Elektronenmikroskopie ermöglicht.
Methodenartikel
Durchführung von Immunhistochemie an einem nicht-menschlichen Primaten-Hirngewebe
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Immunhistochemie vor dem Einbetten (Abbildung 1C)
- Bereiten Sie eine 4-l-Stammlösung aus Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, 50 mM, pH 7,6) wie folgt vor.
- Messen Sie 2 l destilliertes Wasser in ein 4-Liter-Becherglas, fügen Sie 24,23 g Trihydroxymethylaminomethan (THAM; C4H11NO3) und umrühren, bis es sich auflöst.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 mit ca. 148 ml 1 N HCl ein. Die Zugabe der Säure sollte mit Vorsicht erfolgen, um einen pH-Wert unter 7,6 zu vermeiden. Das Gesamtvolumen sollte 4 l betragen.
ACHTUNG: HCl ist stark korrosiv. Tragen Sie die entsprechende PSA.
- Wählen Sie Abschnitte aus, die die interessierende Region enthalten, die für die EM-Immunhistochemie verarbeitet werden soll.
- Waschen Sie die frei schwimmenden Abschnitte 3x in PBS (0,1 M, pH 7,4) für 5 min bei RT, um die Frostschutzlösung zu spülen.
- Bereiten Sie eine 0,5%ige Lösung von NaBH4 in PBS verdünnt vor.
- Wiegen Sie 0,05 g NaBH4 und verdünnen Sie es in 10 ml PBS. Nicht abdecken. Bereiten Sie diese Lösung kurz vor Gebrauch vor.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in der frisch zubereiteten NaBH4 Lösung für 30 min bei RT. Schütteln Sie vorsichtig. Nicht abdecken.
- 3x in PBS für 10 min bei RT waschen und dabei kräftig schaukeln, bis kein Reaktionsgas mehr übrig ist.
- Bereiten Sie eine Blockierungslösung für EM mit 2 % geeignetem normalem Serum und 0,5 % kalter Fischgelatine, verdünnt in PBS, vor.
HINWEIS: Die Menge sollte berechnet werden, um genug für die folgenden drei Schritte zu haben. Verwenden Sie ein Serum, das aus der gleichen Tierart hergestellt wurde, die den Sekundärantikörper enthält. Vermeiden Sie die Verwendung von Antigen-Retrieval-Methoden oder die Zugabe kleiner Mengen Triton (um die Penetration von Antikörpern zu erhöhen), da diese Methoden die Qualität des Gewebes erheblich beeinträchtigen. - Inkubieren Sie die Abschnitte 1 h lang in der Blockierlösung bei RT. Schaukeln Sie vorsichtig.
- Bereiten Sie die in der Blockierungslösung verdünnte Primärantikörperlösung vor.
HINWEIS: Die Konzentration des Primärantikörpers ist in der Regel die gleiche wie die der LM-Immunhistochemie, aber erwägen Sie, vorher Tests mit anderen Antikörperkonzentrationen durchzuführen, da einige Primärantikörper möglicherweise nicht mit Acrolein wirken. Wenn ja, ist es möglich, eine Mischung aus Glutaraldehyd (0,1 - 2%) und 4% PFA für die transkardiale Perfusion zu verwenden und ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Optimieren Sie auch die Inkubationszeit und -temperatur. - Inkubieren Sie die Schnitte über Nacht in der primären Antikörperlösung bei RT unter leichtem Schaukeln. Verwenden Sie eine zuvor getestete Inkubationszeit und -temperatur.
- Waschen Sie die Abschnitte 3x in PBS für 5 min bei RT unter leichtem Schaukeln.
- Bereiten Sie eine 1:1.000-Lösung aus biotinyliertem Sekundärantikörper vor, der in der Blockierungslösung verdünnt ist.
HINWEIS: Der Sekundärantikörper muss gegen die Wirtsspezies erhoben werden, die zur Erzeugung des Primärantikörpers verwendet wurde. - Inkubieren Sie die Schnitte in einer Sekundärantikörperlösung für 1,5 h bei RT. Schütteln Sie vorsichtig.
- Bereiten Sie mindestens 60 Minuten vor dem Ende der Sekundärantikörperinkubation eine Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC)-Lösung vor.
- Verwenden Sie eine kalibrierte Pipette, um 8,80 μl/ml der Lösungen A und B zu messen und verdünnen Sie sie in PBS.
- Mindestens 60 Minuten lang bei RT leicht schaukeln, um die vollständige Bindung zwischen den Avidin- und Biotin-Molekülen zu ermöglichen.
- Nach der Inkubation in der Sekundärantikörperlösung 3x in PBS für 10 min bei RT waschen.
- Inkubieren Sie die Schnitte in der ABC-Lösung für 1 h bei RT.
- Einmal in PBS und zweimal in TBS für 10 min bei RT waschen und dabei leicht schaukeln.
- Bereiten Sie eine frische Lösung aus 0,05 % 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) mit 0,005 % H2O2 in TBS verdünnt vor.
- 12,5 mg DAB wiegen und in 25 ml kalter TBS verdünnen. Vor Licht schützen.
VORSICHT: Das DAB-Pulver ist leicht flüchtig und schädlich, wenn es eingeatmet wird. Es ist krebserregend und teratogen. Daher sollten schwangere oder stillende Frauen dieses Produkt nicht manipulieren, auch wenn es verdünnt ist. Verwenden Sie bei der Handhabung eine N95-Maske und tragen Sie PSA. - Filtern Sie die Lösung und fügen Sie kurz vor Gebrauch 4,5 μl 30 % H2O2 hinzu.
- 12,5 mg DAB wiegen und in 25 ml kalter TBS verdünnen. Vor Licht schützen.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in der DAB-Lösung für 3 bis 7 Minuten bei RT. Schütteln Sie vorsichtig.
HINWEIS: Der braune Niederschlag sollte nicht zu dunkel sein, um eine hohe Hintergrundfärbung zu vermeiden. Die Inkubationszeit sollte entsprechend optimiert werden. - Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie sich zweimal in kalter TBS waschen, dann zweimal für 10 Minuten in kalter TBS bei RT, gefolgt von zweimal für 10 min in PB, mit leichtem Schaukeln.
HINWEIS: Die Verwendung von PB (und nicht PBS) ist entscheidend, um alle Spuren von NaCl zu eliminieren, da es mit Osmium reagieren und Kristalle bilden würde.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Schematische Darstellung der wesentlichen Schritte des Protokolls. Das Affengehirn (A) wird mit einem kühlenden Vibratom (B) in serielle Abschnitte ...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dibasisches wasserfreies Natriumphosphat | |||
| Monobasisches Monohydrat Natriumphosphat | |||
| Natriumchlorid (NaCl) | |||
| Hydroxymethylaminomethan (THAM)< | |||
| HCl | |||
| NaOH | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Acrolein (90%) | |||
| Autopsie Entlüftungstabelle | |||
| Elektronische Perfusionspumpe | |||
| Needle (Perfusion) | |||
| Needle | |||
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Acepromazine | |||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | |||
| Surgical scissors< | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | |||
| Vibratome Rasierklinge | |||
| Glycerol | |||
| Ethylenglykol< | |||
| Normales Pferdeserum | 008-000-121 | ||
| Kalte Fischgelatine | |||
| Primärer Antikörper, SERT< | |||
| Primärer Antikörper, ChAT | |||
| Primärer Antikörper, TH | |||
| Biotinylierter Sekundärantikörper, mouse< | |||
| Vectastain Elite ABC kit< | |||
| 3'3 diaminobenzidin (DAB) | |||
| Peroxid 30% |
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