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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
- Tissue Staining
<- span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>In einer lichtdichten Färbebox erstellst du eine "Feuchtigkeitskammer" mit fusselfreiem Gewebe, das mit entionisiertem Wasser getränkt ist.
- Trocknen Sie die Ränder des Objektträgers mit einem fusselfreien Taschentuch, verwenden Sie einen Mini-Pap-Stift, um einen flüssigkeitsabweisenden Rand am äußersten Rand des Objektträgers zu machen, weg von Gewebeabschnitten. Dieser Rand sollte ausreichend Platz zwischen dem Meniskus der Flüssigkeit und dem Rand des Gewebes gewährleisten, damit die Oberflächenspannung die Färbung nicht beeinträchtigt.
HINWEIS: Der Pap-Pen-abweisende Rand kann vor 1.1.3 angewendet werden, wenn die Antikörper von Interesse keine Mikrowellen-Antigen-Entnahme erfordern. Wenn der Pap-Pen vor dem Waschen in PBS aufgetragen wurde, muss in diesem Schritt die Unversehrtheit des flüssigkeitsabweisenden Randes überprüft werden. Verwende einen Mini-Pap-Stift, um Lücken im Rand zu füllen. - Mit horizontal gelegten Objektträgern, blockieren Sie die unspezifische Antigenbindung, indem Sie in 4% v/v Serum in PBS (Blocklösung) inkubieren. Pipettieren Sie 300 μl Blocklösung pro Objektträger für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass sich die Blocklösung bis zum Pap-Pen am Rand des Objektträgers erstreckt und das Gewebe vollständig bedeckt, um ungleichmäßige Flecken durch Oberflächenspannung in der Nähe des Gewebes zu vermeiden.
- Verwenden Sie Serum von der gleichen Spezies, in der der Sekundärantikörper hergestellt wird. Hinweis: Bei diesem Verfahren werden die Sekundärantikörper im Esel hergestellt, und somit wird Eselsserum verwendet. Wenn Sekundärantikörper von zwei oder mehr verschiedenen Spezies verwendet werden, fügen Sie Serum von jeder Spezies hinzu.
- Primären Antikörper auf Objektträger pipettieren. Hinweis: Die Antikörperkonzentrationen für diese Färbung wurden auf 1:5.000 bzw. 1:500 für Iba1 bzw. Pan-neuronal optimiert. Es wurde festgestellt, dass diese Konzentrationen eine signifikante Färbung ohne Hintergrundfärbung zeigen.
- Verdünnen Sie die Blocklösung auf 1% Serum in PBS und fügen Sie primäre Antikörper hinzu. 300 μl Primärantikörperlösung in 1 % Serum pro Objektträger pipettieren. Stellen Sie auch hier sicher, dass sich die Flüssigkeit am Rand des Pap-Pens befindet. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Füge drei Kontrollfolien hinzu: einen, der weder Iba1 noch panneuronale Antikörper enthält, einen mit Iba1 ohne panneuronalen Antikörper und einen mit panneuronalen Antikörpern ohne Iba1. Färben Sie diese Objektträger im selben Lauf mit den gleichen Lösungen, lassen Sie jedoch die Primärantikörper weg, um die unspezifische Bindung der Sekundärantikörper zu testen.
- Waschen Sie am nächsten Morgen die Objektträger dreimal für jeweils 5 Minuten in PBS und wechseln Sie die Lösung zwischen den Wäschen.
- Fluoreszierende Antikörper sind lichtempfindlich, daher minimieren Sie ab diesem Schritt die Lichteinwirkung, indem Sie sicherstellen, dass die Waschbehälter in Folie eingewickelt sind und die Hybridisierungsboxen entweder schwarz sind oder im Dunkeln inkubiert werden. Die entsprechenden Sekundärantikörper werden auf alle Objektträger pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur bei einer Konzentration von 1:250 in Blocklösung (siehe Schritt 1.2.3) in einer lichtdichten "Feuchtigkeitskammer" (siehe Schritt 1.2.1) inkubiert.
- Verwenden Sie Sekundärantikörper unterschiedlicher Wellenlängen. Verwenden Sie hier für den primären Antikörper Kaninchen anti-Iba1 esel anti-kaninchen 594 als geeigneten sekundären Antikörper. Für den primären Maus-Anti-Pan-Neuronal-Antikörper ist Esel-Anti-Maus 488 als geeigneter Sekundärantikörper zu verwenden. Alternativ können Sie Anti-Kaninchen 488 und Anti-Maus 594 verwenden.
- Waschen Sie Folien dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten.
- Optional: Kernfärbung durchführen.
- In Hoechst (oder einem anderen Kernfärbe) in einer Konzentration von 0,03 μg/ml in doppelt destilliertem H2O genau 60 Sek. lang.
- Waschen Sie Folien dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten.
- Wash in ddH2O.
- Coverslipping
- Deckglas mit einem wässrigen Eindeckmedium, wie z.B. Fluoromount-G oder ProlongGold. Achten Sie darauf, alle Blasen mit einem Applikator mit Wattespitze zu entfernen.
Hinweis: Andere Eindeckmittel könnten verwendet werden, jedoch wurde von einigen innerhalb weniger Tage nach dem Deckglas ein hohes Durchscheinen zwischen den Färbungen festgestellt. - Verwenden Sie klaren Nagellack, um die Ränder zu versiegeln und zu verhindern, dass die Abschnitte durch Verdunstung austrocknen. Lassen Sie den Nagellack in einem lichtdichten Behälter trocknen, während die Objektträger flach und bei Raumtemperatur bleiben, und lagern Sie ihn dann in einem lichtdichten, in Folie eingewickelten Behälter bei 4 °C.