Immunhistochemische Färbung von Biomarkern in Hirntumor-Neurosphärenschnitten

Zusammenfassung

Quelle: Núñez, F. J., et al. Bewertung von Biomarkern bei Gliomen durch Immunhistochemie an paraffineingebetteten 3D-Gliom-Neurosphärenkulturen. J. Vis. exp. (2019).

Dieses Video demonstriert eine immunhistochemische Technik zur Markierung von Tumor-Biomarkern in paraffineingebetteten Hirntumor-Neurosphären. Die Neurosphärenabschnitte werden einer Paraffinentfernung und Rehydrierung unterzogen, gefolgt von einer Behandlung, um Biomarkerstellen freizulegen. Primär- und Sekundärantikörper werden dann aufgebracht, um diese Biomarker zu markieren. Die Sekundärantikörper werden durch Avidin-konjugierte Peroxidase-Enzyme gebunden, die chromogene Substrate oxidieren, um Biomarker-Positionen anzuzeigen. Schließlich werden die nukleare Gegenfärbung und die Vorbereitung des Objektträgers für die mikroskopische Analyse abgeschlossen.

Protokoll

1. Immunhistochemie (IHC) von Paraffin-eingebetteten Neurosphären (NS)

1. Schmelzen Sie Paraffin, indem Sie die Objektträger in ein Metallgestell legen und bei 60 °C für 20 min inkubieren.
2. Entparaffinieren Sie die Objektträger durch Inkubation in einem Rehydratationszug bei Raumtemperatur (RT): 3x Xylol für 5 min, 100% 2x Ethanol für 2 min, 95% 2x Ethanol für 2 min, 70% 1x Ethanol für 2 min und 1x deionisiertes Wasser für 2 min. Bewahren Sie die Objektträger bis zur Antigengewinnung in Leitungswasser auf, da das Austrocknen zu einer unspezifischen Antikörperbindung führt.
3. Inkubieren Sie die Objektträger in Citratpuffer (10 mM Zitronensäure, 0,05% nichtionisches Detergens, pH 6) bei 125 °C für 30 s und bei 90 °C für 10 s. Lassen Sie sie abkühlen und spülen Sie die Objektträger dann 5 Mal mit destilliertem Wasser ab.
4. Inkubieren Sie Objektträger bei RT in 0.3% H₂O₂ für 30 min.
5. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal in Waschpuffer (0,025% Waschmittel in Tris-gepufferter Kochsalzlösung [TBS]) für 5 Minuten unter leichtem Rühren.
6. Inkubieren Sie die Objektträger bei RT mit Blockierungslösung (10% Pferdeserum, 0,1% Rinderserumalbumin [BSA] bei TBS) für 30 Minuten.
7. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer mit primärem Antikörper, der in Verdünnungslösung (0,1% BSA in TBS) hergestellt wurde. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang unter leichtem Rühren in Waschpuffer
.
8. Inkubieren Sie die Objektträger 1 h lang bei RT mit einem biotinylierten Sekundärantikörper, der in Verdünnungslösung hergestellt wurde. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang unter leichtem Rühren in Waschpuffer
.
9. Inkubieren Sie die Objektträger bei RT im Dunkeln für 30 min mit dem Avidin-Biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-Komplex. Waschen Sie die Objektträger 3 Mal 5 Minuten lang unter leichtem Rühren in Waschpuffer
.
10. Inkubieren Sie die Objektträger hier für 2-5 min bei RT mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-H₂O₂ Substratmarken.
11. 3 mal mit Leitungswasser spülen. Tauchen Sie die Objektträger (1-2 s) in Hämatoxylinlösung, um sie zu verfärben, und spülen Sie sie dann gründlich mit Leitungswasser ab, bis sie klar sind.
12. Dörren Sie die Objektträger wie folgt: 2 min in destilliertem Wasser inkubieren, 3 mal in 80% Ethanol tauchen, 2 mal je 2 min in 95% Ethanol inkubieren, 2 mal je 2 min in 100% Ethanol inkubieren und schließlich 3 mal je 3 min in Xylol.
13. Decken Sie die Dias mit einem Xylol-basierten Eindeckmedium ab und lassen Sie sie auf einer ebenen Fläche bei RT trocknen, bis sie für die Bildgebung bereit sind.

HINWEIS: Wenn Sie DAB-Färbungen durchführen, können die Dias bei RT gelagert werden. Wenn jedoch eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt wird, sollten Objektträger im Dunkeln bei -20 °C gelagert werden, um das Photobleichen zu reduzieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polyklonales Anti-ATRX gegen Kaninchen,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:250 Verdünnung
Polyklonales Kaninchen-Anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 Verdünnung
Kaninchen polyklonales Anti-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, 1:500 Verdünnung
Ziegenpolyklonales Anti-Kaninchen-Biotin-konjugiert	Dako	E0432	IHC, 1:1000 Verdünnung
Vectastain Elite ABC HRP Kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/Preis bis 12/18