Ultrastrukturelle Analyse eines Schnitts aus dem Gehirn einer Maus mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Abstract

Quelle: Lutz, D., et.al. Beurteilung der ultrastrukturellen Neuroplastizitätsparameter nach in utero-Transduktion des sich entwickelnden Mausgehirns und des Rückenmarks. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Präparation und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse eines Gehirnschnitts eines Maus-Welpen. Das Protokoll beginnt mit Osmiumtetroxid-fixiertem Gewebe, das in Harz eingebettet ist, gefolgt von präzisem Trimmen zur Isolierung der interessierenden Region und Ultramikrotomie zur Herstellung von halbdünnen und ultradünnen Schnitten, die mit Lichtmikroskopie bzw. TEM sichtbar gemacht werden.

Protocol

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Auswahl von ultrastrukturellen Neuroplastizitätsparametern für die quantitative Analyse

1. Kartierung des Interessenbereichs
   1. Wählen Sie einen Interessenbereich (z. B. Hippocampus oder Kleinhirn) und lokalisieren Sie den Bereich im Schnittatlas, indem Sie das Bild aus dem Atlas auswählen, das diesen Bereich enthält.
   2. Skizzieren Sie die Ränder des interessierenden Bereichs auf das Schnittbild und suchen/überlagern Sie diese Bereichsgrenzen mit der Harzprobe.
   3. Ritzen Sie die Ränder des interessierenden Bereichs (z. B. Hippocampus oder Kleinhirn) mit einer feinen Nadelstärke (26 G, 1 Zoll) auf die Harzprobe.
   4. Erhitzen Sie die Harzprobe in einem Ofen auf 85 °C, um das Harz zum Trimmen weicher zu machen, oder verwenden Sie alternativ ein Trimmgerät, eine dünne Klinge oder Schleifpapier.
   5. Entfernen Sie den interessierenden Bereich mit einer Rasierklinge aus der Harzprobe. Montieren Sie die Probe mit Kleber auf Haltestangen aus Acrylglas des erforderlichen Kalibers (z.B. mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Länge von 1 cm). Trimmen Sie die eingefasste Probe für halb- und ultradünne Schnitte.
   6. Bereiten Sie halbdünne (0,75 μm) und ultradünne (70 nm) Schnitte des getrimmten Bereichs mit einem Ultramikrotom vor: Stellen Sie es auf 1,5 mm/s für eine Dicke von 0,75 μm und auf 0,7 mm/s für eine Dicke von 70 nm ein.
   7. Sammeln Sie die halbdünnen Schnitte auf Glasträgern und färben Sie die Schnitte mit 1% Toluidinblau in PBS (4 min).
   8. Waschen Sie die Abschnitte mehrmals in entionisiertem Wasser. Untersuchen Sie die gefärbten Schnitte unter dem Lichtmikroskop mit 4x (NA von 0,1 ∞/-), 10x (NA von 0,22 ∞/0,17), 40x (NA von 0,65 ∞/0,17) und 100x (NA von 1,25 ∞/0,17) Objektiven.
   9. Sammeln Sie ultradünne Schnitte auf Nickelgittern. Setzen Sie die Gitter einer TEM bei 180 kV und einer 3.200-fachen, 6.000-fachen und/oder 8.000-fachen Vergrößerung aus.
2. TEM-Analyse
   1. Wählen Sie die ultrastrukturellen Parameter, die für die quantitative TEM-Analyse von Interesse sind (z. B. Boutons mit Vesikeln und Mitochondrien oder myelinisierte und nicht-myelinisierte Axone) und nehmen Sie TEM-Bilder dieser Parameter unter 3.500-facher, 6.000-facher und/oder 8.000-facher Vergrößerung auf.

Materials