Transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung der synaptischen Vesikel-Endozytose in Hippocampus-Neuronen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Villarreal, S., et. al., Messung der synaptischen Vesikel-Endozytose in kultivierten Hippocampus-Neuronen. (2017)

Dieses Video zeigt die Analyse der synaptischen Vesikelendozytose in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Meerrettichperoxidase-Markierung und Elektronenmikroskopie.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

Elektronenmikroskopie

1. Bereiten Sie eine hohe K⁺ Stimulationslösung mit HRP (Meerrettichperoxidase) als 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM Glukose, 2 mM MgCl₂, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 und 5 mg/ml HRP, dann auf pH 7,4 mit 5 M NaOH einstellen.
   1. Stimulieren Sie die Neuronenkultur des Hippocampus mit 1,5 ml hoher K⁺ Stimulationslösung bei Raumtemperatur (bezeichnet als K⁺) durch Zugabe von 1,5 mL zu jeder Vertiefung für 90 s. Im Ruhezustand (als R bezeichnet) die gleiche Konzentration von 5 mg/ml HRP für 90 s anwenden, jedoch mit normaler Kochsalzlösung. Für die Rückgewinnungsprobe wird eine Stimulationslösung mit hohem K⁺-Gehalt wie bei der K⁺-Probe aufgetragen, dann schnell gewaschen und durch normale Kochsalzlösung ersetzt und 10 Minuten lang inkubiert.
2. Fixierung und Färbung
   
   1. 000000000 0,1 M Na-Cacodylatpuffer mit 21,4 g/L Na-Cacodylat bei einem pH-Wert von 7,4 herstellen. Die Zellen werden mit 4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Na Cacodylatpuffer für mindestens 1 h bei Raumtemperatur fixiert. Dreimal mit 0,1 M Na Cacodylatpuffer für jeweils 7 min waschen.
   2. Diaminobenzidin (DAB)-Lösung, bestehend aus 0,5 mg/ml DAB mit 0,3 % H₂O₂ in ddH₂O, herstellen und mit einem 0,22-μm-Filter filtrieren. 1,5 mL DAB-Lösung für 30 min bei 37 °C auftragen. Dreimal mit 0,1 M Na Cacodylatpuffer für jeweils 7 min waschen.
      VORSICHT: DAB ist ein giftiges und im Verdacht stehendes Karzinogen. Bitte tragen Sie Handschuhe und Laborkittel.
      HINWEIS: Die Markierung mit DAB erfolgt aufgrund seiner Oxidation durch H₂O₂, wie durch HRP katalysiert. Kleine Erhöhungen der Komponenten führen zu einem erhöhten Signal in der Probe. Eine Erhöhung der HRP-Konzentration beschleunigt die Wirkung des Katalysators. Ausreichend hohe Konzentrationen von H₂O₂ ermöglichen schwächende Nebenreaktionen mit HRP und hemmen die Wirkung der Markierung³². In dieser Arbeit wurden die Konzentrationen dieses Markierungssystems auf der Grundlage der derzeit verfügbaren Forschungsergebnisse ausgewählt.
   3. Inkubieren Sie die Neuronen mit 1,5 mL 1% OsO₄ in 0,1 M Na Cacodylatpuffer für 1 h bei 4 °C als Nachfixierung. Dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Na Cacodylatpuffer für jeweils 7 min waschen.
      VORSICHT: Aufgrund der Toxizität und Reaktivität von OsO₄ ist es in vielen Fällen besser, die Probe in einer chemischen Haube auf Eis zu halten, als einen Kühlschrank für die Inkubation zu verwenden.
   4. Bereiten Sie 0,1 M Natriumacetatpuffer mit 13,61 g/l Natriumacetat und 11,43 ml/l Eisessig bei pH 5,0 vor. Dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Acetatpuffer bei pH 5,0 für jeweils 7 min waschen und mit 1,5 mL 1 % Uranylacetat in 0,1 M Acetatpuffer bei pH 5,0 für 1 h bei 4 °C inkubieren. Dreimal mit 1,5 mL 0,1 M Acetatpuffer für jeweils 7 min waschen.
      
3. Epoxideinbettung
   
   1. Dehydrieren Sie die Neuronenkultur mit einzelnen 1,5-ml-Waschgängen mit 50 %, 70 % und 90 % Ethanol für jeweils 7 Minuten und dann 3 Waschgängen mit 1,5 ml 100 % Ethanol für jeweils 7 Minuten in einem Abzug.
   2. Mischen Sie 485 ml/l Bisphenol-A-(Epichlorhydrin)-epoxidharz, 160 ml/l Dodecenylbernsteinsäureanhydrid (DDSA), 340 ml/l Methyl-5-Norbornen-2,3-dicarbonsäureanhydrid (NMA) und 15 ml/l 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30), um das Epoxidharz herzustellen. Gründlich mischen und dann unter Vakuum lagern, um Luftblasen zu entfernen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Luftblasen im Harz zu entfernen, insbesondere solche, die kleiner als mit bloßem Auge sichtbar sind, da sie beim Schneiden Hohlräume im Harz verursachen können.
   3. Infiltrieren Sie die Probe, indem Sie das Ethanol 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler durch 50 % Epoxidharz in Ethanol ersetzen, dann 30 % Epoxidharz in Ethanol bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
   4. Die Epoxidharzlösung mit 100 % Epoxidharz austauschen und 10 min bei 50 °C inkubieren. Frisches 100 % Epoxidharz zweimal austauschen und 1 h bei 50 °C inkubieren. Frisches 100 % Epoxidharz hinzufügen und über Nacht bei 50 °C und dann über 36 h bei 60 °C aushärten lassen.
4. Entnehmen Sie jede Probe mit der Handsäge eines Juweliers aus der Multi-Well-Platte. Wählen Sie mit einem inversen Lichtmikroskop die interessierenden Bereiche und dichte Zellkonzentrationen aus und schneiden Sie dann 70- bis 80-nm-Blöcke für die Schnitte nach Mikrotom. Montieren Sie den Schnittbereich in das Mikrotomfutter und laden Sie das Mikrotom. Positionieren Sie das Spannfutter im Mikrotom und montieren Sie ein Diamantmesser, dessen Schneide parallel zur Oberfläche des Blocks verläuft. Sammeln Sie Abschnitte mit einer Dicke von 70 bis 80 nm direkt auf einzelne Gitter.
5. Löse Uranylacetat in Wasser für eine 1%ige Lösung und löse Bleicitrat separat in Wasser für eine 3%ige Lösung nach Gewicht. Die Schnitte werden durch Eintauchen mit 1 % wässrigem Uranylacetat für 15 min und dann mit 3 % wässrigem Bleicitrat für 5 min gegengefärbt, um den Kontrast der Proben zu verbessern.
6. EM-Bildgebung
   1. Untersuchen Sie die Schnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop und nehmen Sie Bilder mit einer CCD-Digitalkamera bei einer Primärvergrößerung von 10.000-20.000X auf.

Materialien