Biolumineszenz-Bildgebung der Neuroinflammation bei einer transgenen Maus

Zusammenfassung

Quelle: Breid, S., et. al. Biolumineszenz-Bildgebung der Neuroinflammation bei transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein-Fibrillen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen und zeigt Luciferase-Luciferin-Reaktionen in aktivierten Astrozyten. Das Protokoll ermöglicht die nicht-invasive Quantifizierung der astrozytären Aktivierung und unterstützt Studien zur ZNS-Entzündung und zur therapeutischen Wirksamkeit.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

Tiermodell

1. Kreuzen Sie hemizygote Tg(Gfap-luc+/-) Mäuse, um hemizygote bigene Tg(M83+/-) Mäuse zu erzeugen, um hemizygote bigene Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) Mäuse zu erzeugen.
2. Genotypisierung der Nachkommen mittels real-time PCR auf das Vorhandensein des Transgens, das für humanes Alpha-Synuclein kodiert, und mit Standard-PCR auf Glühwürmchen-Luciferase.
3. Impfen Sie die Tiere im Alter von sechs bis acht Wochen.

Inokulum-Vorbereitung

1. Monomeres rekombinantes humanes Alpha-Synuclein mit der A53T-Mutation in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS)-Puffer herstellen, der 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) enthält.
2. Bereiten Sie fibrilläres Alpha-Synuclein für die Inokulation vor, indem Sie 3 μg/μl monomeres rekombinantes humanes Alpha-Synuclein in einem Orbitalschüttler bei 800 U/min und 37 °C für 5 Tage rühren.
3. Fibrillenanordnungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen, um eine Endkonzentration von 1 μg/μl für intraperitoneale Inokulationen zu erreichen.
4. Fragmentieren Sie die Alpha-Synuclein-Fibrillen mit einem Stäbchensonicator für 1 Minute (40 Pulse mit einer Dauer von 0,5 s mit einer Pause von einer Sekunde zwischen jedem Puls und einer Amplitude von 50 %) auf Eis. Zur Vermeidung von Kontaminationen durch Kreuzsaat. Verwenden Sie saubere Ultraschallsonden, um verschiedene Inokula vorzubereiten.

Intraperitoneale Injektionen

1. Bei intraperitonealen Injektionen narkotisieren Sie die Tiere kurz in einer Anästhesiekammer durch Inhalation mit Isofluran/Sauerstoff bei einer Flussrate von 2 l/min und stellen den Verdampfer auf 2% ein. Kneifen Sie den Zeh des Tieres ein und vergewissern Sie sich, dass es seine Hintergliedmaßen nicht zurückzieht, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.
2. Füllen Sie eine 27 G Einweg-Injektionsspritze mit 50 μl beschallten Alpha-Synuclein-Fibrillen oder PBS.
3. Injizieren Sie direkt in das Bauchfell der Maus und vermeiden Sie das Eindringen in den Dünndarm oder Blinddarm hinter der Bauchdecke, indem Sie das Tier in einer dorsalen Position halten, wobei der Kopf vom Untersucher weg und in einem Winkel von etwa 45° nach unten zeigt. Überwachen Sie die Tiere, bis sie sich von der Narkose erholt haben.

Biolumineszenz-Bildgebung

1. Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) Mäuse alle 2-4 Wochen mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem.
2. Vor der Bildgebung werden die Mäuse in einer Isofluran/Sauerstoff-Kammer mit einer Flussrate von 2 l/min und einem auf 2% eingestellten Verdampfer kurz anästhesiert. Kneifen Sie den Zeh des Tieres ein und vergewissern Sie sich, dass es seine Hintergliedmaßen nicht zurückzieht, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.
3. Rasieren und enthaaren Sie die Köpfe der Mäuse mit einer Enthaarungscreme. Färben Sie die Ohren schwarz mit einem nicht reizenden Marker, um unspezifische Biolumineszenz zu blockieren.
4. Verdünnen Sie D-Luciferin-Kaliumsalz, das Substrat der Luciferase, in PBS zu einer Stammlösung von 30 mg/ml. Lagern Sie es in 1 mL Aliquots bei -20 °C. Schützen Sie das gelöste D-Luciferin vor Lichteinwirkung.
5. Wiegen Sie die Tiere vor der Injektion. Berechnen Sie das genaue Volumen von D-Luciferin zur Injektion von 150 mg/kg Körpergewicht. Injizieren Sie intraperitoneal D-Luciferin und bringen Sie das Tier in die Anästhesiekammer zurück.
6. Starten Sie die Imaging-Software. Nachdem das Imaging-System seine Betriebstemperatur erreicht hat, initialisieren Sie das System, indem Sie auf die Schaltfläche "Initialisieren" in der Systemsteuerung klicken.
7. Wählen Sie die Schaltflächen "Lumineszierend" und "Fotografieren". Stellen Sie die Belichtungszeit auf 60 s, das Binning auf 'Medium', die F/Stop auf '1' und die EM-Verstärkung auf 'Off'.
8. Vergewissern Sie sich, dass der Anregungsfilter auf "Block" und der Emissionsfilter auf "Offen" eingestellt ist, und stellen Sie die Höhe des Probanden auf 1,50 cm ein.
9. Zehn Minuten nach der Injektion mit D-Luciferin legen Sie die Tiere auf die Heizplatte in der Bildgebungskammer und stellen Sie sicher, dass ihre Schnauzen korrekt in den Anästhesieauslass eingesetzt werden. Schließen Sie den Isofluran/Sauerstoff-Fluss aus der Inhalationskammer und öffnen Sie den Fluss für die Bildgebungskammer mit einer Durchflussrate von 0,25 l/min und einer Verdampfung von 2%. Schließen Sie die Tür der Bildgebungskammer ordnungsgemäß.
10. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen", um die Biolumineszenz zu messen, die 60 s dauert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
27-gauge syringe	VWR	613-4900<
Isofluran	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Depilatory cream	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000<
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648<
IVIS Lumina II imaging system	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) Mäuse oder B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	The Jackson Laboratory	4479<

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