Dieses Video zeigt die Methode der retrograden Markierung von Drosophila Motoneuronen unter Verwendung lipophiler Farbstoffe. Der Farbstoff dringt in das Axon ein, wandert rückwärts und markiert die Neuronen grün, was eine detaillierte Visualisierung ihrer Morphologie und Projektionen unter einem konfokalen Mikroskop ermöglicht.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Retrograde Markierung von Drosophila-Motoneuronen mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen
869 Ansichten
⸱
28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Ausrüstung und Zubehör
- Materialien zum Sammeln von Embryonen und zum Training von Erwachsenen zur Eiablage
- Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50-ml-Röhrchen durchtrennen und ein Loch in der Kappe aufschneiden, um einen Netzfilter mit Poren von 100 μm einzustellen (Materialtabelle) zwischen dem Rohr und der Kappe.
HINWEIS: Alternativ können Zellsiebe mit Poren von 100 μm (Materialtabelle) für den Filtrationsschritt der Embryonenentnahme verwendet werden. - Stelle Agarplatten mit Trauben-Agar-Vormischung (Materialtabelle) gemäß den aufgeführten Anweisungen her. Rühren Sie kurz eine Packung der Pulvermischung vorsichtig in 500 ml destilliertes Wasser bei Raumtemperatur (RT, 23 °C) (dH2O) ein und erhitzen Sie die aufgelöste Mischung in der Mikrowelle. Nach dem Abkühlen auf 70–75 °C die Mischung in Petrischalen (60 mm) füllen. Nachdem der Agar erstarrt ist, lagern Sie die Platten bei 4 °C.
- Bereite Hefepaste vor, indem du aktive Trockenhefe (Tabelle der Materialien) und Wasser zu einer Pastenkonsistenz mischst und bei 4 °C hältst.
- Verwenden Sie Eiersammelkäfige (für 60 mm Petrischale, Materialtabelle), die einen ausreichenden Luftstrom bieten.
- Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50-ml-Röhrchen durchtrennen und ein Loch in der Kappe aufschneiden, um einen Netzfilter mit Poren von 100 μm einzustellen (Materialtabelle) zwischen dem Rohr und der Kappe.
- Vorbereitung von Präpariernadeln und Farbstoffinjektions-Mikropipetten
- Präparation der Farbstoffinjektions-Mikropipette und Präpariernadel aus demselben Kapillarschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm und einem Außendurchmesser von 1,2 mm (Materialtabelle). Ziehen Sie den Kapillarschlauch mit einem Mikropipettenabzieher bei 7 % von 170 V maximaler Leistung (Materialtabelle), um eine scharfe Nadel mit einer Verjüngung von ~0,4 cm Länge zu erhalten.
- Für die Farbstoffinjektion passen Sie die Mikropipette mit einer Mikropipette an, die durch eine im Handbuch des Geräts beschriebene Blasenabschrägungstechnik abgeschrägt wurde (Tabelle der Materialien).
- Kurz gesagt, tränken Sie die Mühle mit einem Netzmittel (Tabelle der Materialien), um zu verhindern, dass das Wasser die Nadelspitze 'zieht'. Setzen Sie die Nadel in einem Winkel von 25-30° auf die Mikropipettenklemme und senken Sie die Spitze auf zwei Drittel des Radius von der Mitte der Abschrägungsfläche ab. Schleifen Sie die Nadel, während eine Spritze mit Schlauch Luft in die Nadel drückt, um sicherzustellen, dass die Mikropipette frei von Glasspänen ist.
- Markieren Sie die Mikropipette mit einem Permanentmarker mit feiner Spitze, um die Position der Öffnung an der Spitze nach dem Abschrägen anzuzeigen, da es schwierig ist, die schmale Öffnung der Mikropipette, die schräg geformt ist, zu lokalisieren.
2. Vorbereitung für die Embryonenentnahme
- Stellen Sie sicher, dass die erwachsenen Fliegen (20-40 Wildtyp-Kantons-S- oder weiße Fliegen), Männchen und Weibchen, in jungen (<7 Tagen) und unter gesunden Bedingungen für die ideale Eizellentnahme gehalten werden.
HINWEIS: Um die Eiablage zu stimulieren, werden Fliegen mindestens einmal täglich in ihrem Eiersammelkäfig auf Agarplatten trainiert, die mit Hefepaste bestrichen sind.
3. Embryo Staging
- Lassen Sie die Fliegen über Nacht (oder mindestens 15 Stunden) bei RT Eier legen, um die Embryonen 15 Stunden nach der Eiablage (AEL), d.h. im Stadium 16, zu sammeln, um die Dendritogenese der Motoneuronen der vorderen Eckzelle (aCC) und der rohen Garnelen 3 (RP3) zu beobachten. Morgens den Teller mit den Eiern auffangen.
HINWEIS: Die Embryonen bei 15 h AEL haben einen ausgeprägten 4-Kammer-Darm. Für die Bildgebung folgen die verschiedenen Stadien ihren spezifischen morphologischen Kriterien und Alterungsbedingungen. - Um die Embryonen zu sammeln, dechorionieren Sie die auf den Teller gelegten Eier mit 50% Bleiche für 5 Minuten.
- Sobald die Chorionen verschwunden sind, gieße den Inhalt der Platte durch das Filtergerät oder das Zellsieb, um die Embryonen zu isolieren. Verdünnen Sie mit einer Quetschflasche Wasser das auf der Platte verbleibende Bleichmittel und sammeln Sie so viele Embryonen wie möglich, indem Sie die Mischung in den Filter umfüllen.
- Waschen Sie die Embryonen auf dem Filter 3-4x mit mehr Wasser oder bis sich der Bleichgeruch verflüchtigt hat. Nehmen Sie den Filter aus dem Gerät und waschen Sie die Embryonen auf eine andere saubere Platte mit Wasser. Dekantieren Sie das Wasser von der neuen Platte, auf der sich die Embryonen befinden.
- Bereite ein Objektträger vor, indem du es in der Mitte mit zwei Schichten Vinylband bedeckst und ein Rechteck bildest. Schneide mit einer Rasierklinge einen rechteckigen Pool aus dem Klebeband aus. Legen Sie einen dünnen Streifen doppelseitiges Klebeband in Richtung des oberen Endes des Beckens, wo die Embryonen platziert werden, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Mit einer feinen Pinzette einzeln 5-10 Embryonen bei 15 h AEL auswählen und mit der dorsalen Seite nach oben auf das doppelseitige Klebeband legen. Geben Sie Insekten-Ringer-Kochsalzlösung in den Sezierpool, um die Embryonen vor Austrocknung zu schützen (Abbildung 1).
4. Dissektion und Färbung
- Schneiden Sie mit einer Glasnadel unter einem Präpariermikroskop (Materialtabelle) die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren bis zu seinem vorderen Ende. Ziehen Sie dann den Embryo aus der Vitellinmembran vom Klebeband auf das Glas (in Abbildung 1 dargestellt). Achten Sie darauf, das innere Gewebe des Embryos nicht zu beschädigen.
- Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte aus um und befestigen Sie den epidermalen Rand an der Oberfläche des Objektträgers (Abbildung 1, Einschub).
- Mit einer schlauchverbundenen Nadel mit einer Spitzenöffnung von ~300 μm (vorbereitet durch Brechen der dünnen Spitze einer Präpariernadel), saugen oder blasen Sie Luft, um die dorsalen longitudinalen Trachealstämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu lösen und zu entfernen.
- Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die Embryonen 5 Minuten lang bei RT zu fixieren. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBS.
- Färben Sie die Embryonen mit 1 μl Anti-Meerrettich-Peroxidase-Antikörper, konjugiert mit Cyanin-3-Farbstoff (anti-HRP Cy3) (Materialtabelle) in 200 μl PBS für 1 h. Waschen Sie die Embryonen 3x nach dem Färben mit PBS.
HINWEIS: Der Farbstoff von Anti-HRP kann basierend auf den lipophilen Farbstoffen der Wahl für die Injektion geändert werden.
5. Füllung der Injektions-Mikropipette
- Erhitzen von lipophilen Farbstoffen (5 mg/ml 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin, Perchlorat (DiO) oder 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanin, 4-Chlorbenzolsulfonatsalz (DiD), Materialtabelle) in einem 1:10-Gemisch aus Ethanol und Pflanzenöl vor der Verwendung auf 60 °C erhitzen.
- Bereiten Sie einen ölgelösten Farbobjektträger für die Injektionsmikropipette vor. Setzen Sie die Mikropipette in den Kapillarhalter ein (Abbildung 2, #1). Stellen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator (Materialtabelle) so ein, dass sie sich über dem Farbobjektträger befindet. Stellen Sie dann den Tisch so ein, dass die Mikropipette auf dem Farbstoff platziert wird (Abbildung 2, #2).
- Um die Mikropipette zu füllen, verwenden Sie einen Mikroinjektor (Materialtabelle) (Abbildung 2, #3). Sammeln Sie den Farbstoff in der Mikropipette, indem Sie den P i (Injektionsdruck) zwischen 200 und 500 hPa (Hektopascal), den Ti (Injektionszeit) zwischen 0,1 und 0,5 s und Pc (Kompensationsdruck) für 5 min auf 0 hPa einstellen (Abbildung 2, #4).
- Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbträger und legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch. Erhöhen Sie anschließend den Pc-Wert auf einen Bereich von 20-60 hPa, bevor Sie die Mikropipette in die Probe absenken, um eine Kontamination von PBS durch Kapillarwirkung zu verhindern.
6. Farbstoffinjektion in Neurons
- Lokalisieren Sie den Embryo in der Mitte mit dem Mikroskop mit 10-facher Objektivlinse (Materialtabelle) und richten Sie die Mikropipette auf den Embryo aus.
HINWEIS: Die Größe des Farbtröpfchens kann durch Ändern des Pi oder der Größe der Öffnung der Mikropipettenspitze angepasst werden. Das Tröpfchen sollte 10-20 μm groß sein, was ungefähr der Breite von 1 Muskel entspricht. - Ändere das Objektiv in ein 40x Wasser-Immersionsobjektiv (Materialtabelle) und tauche das Objektiv in PBS ein, um den Embryo zu sehen.
- Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um die durch Anti-HRP Cy3 markierte neuronale Morphologie zu überprüfen und die Injektionsstelle zu bestimmen.
- Verwenden Sie während der Injektion Hellfeldmikroskopie, um das Farbtröpfchen zu sehen. Wenn sich der Embryo im Fokus befindet, ändern Sie die Position der Mikropipette, um einen sanften Kontakt mit der Spitze des interessierenden Axons herzustellen (z. B. aCC, RP3).
- Tropfen Sie den Farbstoff in ein Hemi-Segment des rechten Bauches (A2−A6) an der neuromuskulären Verbindung von aCC oder RP3 (Abbildung 3) mit DiD oder DiO, indem Sie die Neuronen verwenden, die mit Anti-HRP Cy3 markiert sind. Mit der Handsteuerung (Maus; Abbildung 2, 5) Geben Sie den Farbstoff frei und entfernen Sie die Mikropipette, nachdem Sie den Farbstoff mit dem Mikromanipulator fallen gelassen haben, und begeben Sie sich zur nächsten Injektionsstelle.
HINWEIS: Im Gegensatz zu anderen Farbstoffen (z.B. Luzifergelb, Calcein), die sich durch Gap Junctions in benachbarte Zellen ausbreiten, verbinden sich lipophile Farbstoffe mit Zellmembranen und übertragen sich nicht auf Nachbarn. Aufgrund der relativ großen Größe des Farbstofftröpfchens führt diese Technik jedoch auch zur Markierung der Partnermuskeln (Abbildung 3A).
- Inkubieren Sie die Probe 1 Stunde lang bei RT nach dem Farbtropfen vor der Bildgebung.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier vor der Montage pausiert werden, und die Probe kann über Nacht bei 4 °C gehalten werden. Lipophile Farbstoffe können auch mittels Iontophorese verabreicht werden, wenn ein intrazellulärer direktgekoppelter (DC) Verstärker ohne weiteres verfügbar ist.
7. Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop
- Entfernen Sie das doppelseitige Klebeband und das Vinylband mit Hilfe einer Pinzette vom Objektträger.
- Bereiten Sie ein Deckglas (22 x 22 mm2 Nr. 1 Deckglas) mit einer kleinen Menge Vakuumfett (Tabelle der Materialien) an den vier Ecken vor und legen Sie es vorsichtig auf die Probe, um Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit Task-Wischern.
- Drücke das Deckglas nach unten, um den Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und der Probe anzupassen. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases vollständig mit Nagellack.
- Bild bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 1: Aufbau des Präparierpools. Die blaue Kammer, die auf dem Glasobjektträger zu sehen ist, besteht aus Vinylband, das die Puffer im Inneren hält. Das doppelseitige Klebeband hält die Embryonen, die richtig ausgericht...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Konfokalmikroskop | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk konfokale Einheit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886< | |
| DiI | ThermoFisher | V22888< | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Doppelseitiges Klebeband | Scotch | 665< | |
| Dow Corning Hochvakuumfett | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Eiersammelkäfig | FlyStuff | 59-100< | |
| FemtoJet 5247< | eingestellt | FemtoJet 4i (Kat.-Nr. 5252000021) | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225< | |
| Micropipette beveler | Sutter style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>BV-10-B | ||
| Nadelabzieher | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-fly Grape Agar Pulver Premix-Packungen | FlyStuff | 47-102< | |
| Nylon net filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyd 16% Lösung, EM grade | Elektronenmikroskopie | 15710< | |
| PBS | Roche | 11666789001 | Verkauft auf sigmaaldrich, boxed 10x Lösung |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510< | |
| Aufrechtes Fluoreszenzmikroskop | Nikon | N/A | Eclipse Ci mit einer LED-Lichtquelle |
| Vinyl-Isolierband | Scotch | 6143< | |
| VWR Cell strainers | VWR | 10199-659< | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Aktive Trockenhefe (RED STAR) |
