Immunfluoreszenzmikroskopie von Nervenzellen, die von peripheren Blutzellen differenziert werden

Zusammenfassung

Quelle: Becker-Kojić, Z. A., et. al., GM-freie Generierung von neuronalen Zellen aus dem Blut. J. Vis. Exp. (2021)

Das Video demonstriert ein Protokoll zur Vorbereitung von Nervenzellen, die aus reprogrammierten peripheren Blutzellen gewonnen wurden, für die Fluoreszenzmikroskopie, wobei unterschiedliche Zelltypen und Entwicklungsstadien durch Immunfluoreszenzbildgebung dargestellt werden.

Protokoll

1. Immunfluoreszenzmikroskopische Analyse von Nervenzellen aus dem Blut
   1. Kultivieren Sie die Zellen 16 Tage lang und entfernen Sie das Medium.
      1. Inkubieren Sie mit einem vorgewärmten Fixiermittel, bestehend aus 75 ml sterilem Wasser und 4 g Paraformaldehyd. Fügen Sie nach Bedarf 10 N NaOH hinzu und rühren Sie, bis die Lösung klar ist. Fügen Sie dann 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl₂, 2 ml 0,5 M EGTA und 4 g Saccharose hinzu. Titrieren Sie auf pH 7,4 mit 6 N HCl und bringen Sie es für 15 min auf 100 mL steriles Wasser.
      2. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 3 Mal für jeweils 5 Minuten. Geben Sie sofort eine frisch hergestellte 0,3%ige Triton X-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen für 5 Minuten. 3 Mal mit PBS waschen und eine Blockierungslösung aus PBS und 5% BSA hinzufügen.
      3. Blockieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippplatte für 1 Stunde.
      4. Bereiten Sie geeignete Verdünnungen von Antikörpern in 1 % BSA/PBS vor und inkubieren Sie die Zellen mit Antikörperverdünnungen auf einer Wippplatte für 1,5 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS für jeweils 5 Minuten, inkubieren Sie die Zellen mit DAPI und montieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedien zur Visualisierung am Mikroskop.
         HINWEIS: Direkt markierte Antikörper, die in diesem Experiment verwendet wurden, sind in der Table of Materials aufgeführt.

Materialien