Analyse von Amyloid-Strukturen in einem Gewebeschnitt mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Nyström, S., et al., Bildgebung von Amyloidgeweben, die mit lumineszierenden konjugierten Oligothiophenen gefärbt sind, durch hyperspektrale konfokale Mikroskopie und Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt die Analyse von Amyloidstrukturen mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie oder FLIM, wobei der hFTAA-Farbstoff verwendet wird, um kompakte Kerne als blau/grün und instabile Peripherien als rot/gelb in farbcodierten Bildern zu zeigen, was die Amyloidorganisation widerspiegelt.

Protokoll

1. Vorbereitung von Gewebeproben

HINWEIS: Viele Gewebetypen können mit Heptamer-Formylthiophenessigsäure (hFTAA) als Amyloidmarker abgebildet werden. hFTAA reagiert empfindlich auf die Aggregatkonformation. Die Färbung sollte daher vorzugsweise an ungestörten Aggregaten ohne Epitopfreilegung durchgeführt werden. Eine optimale spektrale Qualität wird erreicht, wenn die Gewebefixierung auf ein Minimum beschränkt wird. Daher wird frisches gefrorenes Material bevorzugt, das zum Zeitpunkt der Färbung vorsichtig in Ethanol fixiert ist. Es ist jedoch möglich, Amyloid-Ablagerungen auch in Gewebe nachzuweisen, das mit , z.B. , Formalin, fixiert wurde. hFTAA dringt in der Regel gut in das Gewebe ein. Wählen Sie eine Probendicke, die mit dem vorgesehenen bildgebenden Verfahren kompatibel ist.

1. Werden formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Abschnitte verwendet, sollten diese über Nacht in Xylol entparaffinisiert werden. Tauchen Sie dann die Abschnitte jeweils 10 min in aufeinanderfolgende Bäder mit 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH₂O und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Lassen Sie die Gewebeschnitte unter Umgebungsbedingungen trocknen.
   Achtung: Xylol wird immer in einem chemischen Abzug gehandhabt. Xylol und andere organische Lösungsmittel sind schädlich.
   1. Kryosektionen bei Raumtemperatur auftauen. Fixieren Sie die Gewebeabschnitte über Nacht in 10 % Formalin und rehydrieren Sie, indem Sie sie in aufeinanderfolgende Bäder mit 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH₂O und PBS tauchen, jeweils 10 Minuten. Lassen Sie die Gewebeschnitte unter Umgebungsbedingungen trocknen.
2. Geben Sie Tröpfchen der hFTAA-Arbeitslösung (ca. 200 μl) zu den Gewebeschnitten, um sie zu bedecken. Das Tröpfchen sollte durch die Oberflächenspannung an Ort und Stelle bleiben. Zum Färben 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Spülen Sie die Färbelösung mit 500 μl PBS mit einer Pipette ab und tauchen Sie den Objektträger dann für 10 min in das PBS-Bad. Lassen Sie die Sektion unter Umgebungsbedingungen trocknen.
4. Montage mit dem Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht absetzen.

2. FLIM
HINWEIS: Das Konfokalmikroskop ist mit einer Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) ausgestattet.

1. Stellen Sie die folgenden Parameter für das konfokale Mikroskop ein: Lochblende, 20; Anregungswellenlänge, 490 nm; Laserintensität, 0,5 % (entspricht einer durchschnittlichen Leistung von 7,5 μW). Verwenden Sie gepulste Laser bei 40 MHz.

2. Richten Sie in der FLIM-Software die Photonenzählung über 550 nm ein. Befolgen Sie im Fenster Anzeigeparameter die Photonenzählung, bis die maximale Anzahl bei etwa 4.000 Photonenzahlen liegt.

3. Speichern Sie die Datei und exportieren Sie sie als Einzelphotonenzählbild (SPC).

4. Passen Sie die Daten an einen exponentiellen 2-Komponenten-Zerfall in der FLIM-Software an. Eine Passung, die ein χ² < 2 ergibt, ist gut. Der Wert auf der Y-Achse ist die Anzahl der Zählungen für die angegebene Lebensdauer.

5. Wählen Sie einen Schwellenwert für die Anzahl aus, z. B. , z. B. , 100. Farbcode nach T1 und Auswahl der Lebensdauer. Der Zerfall ist abhängig von der Amyloidstruktur, an die das hFTAA gebunden ist. Es wurden Fluoreszenzlebensdauern zwischen 300 und 1.000 ps beobachtet. Speichern Sie die Datei.

6. Exportieren Sie die Rohdaten über die Exportoptionen und speichern Sie die gewünschten Daten in einem neuen Ordner.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako Eindeckmedium	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview-System	ASI Spektralsystem Bildgebung
Spectraview-Software	ASI Spektralbildgebung		& #160;
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 Software	Zeiss
FLIM-System	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Abstimmbarer Laser im Tune	Zeiss

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