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1.Live Bildaufnahme
- Vorbereiten von Zellen für die Live-Bildgebung
1. Kultur von WT- und CCR5-/- hypothalamischen Neuronenzellen, die den mit Grünfluoreszenzprotein markierten Glukosetransporter 4 (GFP-GLUT4) exprimieren, auf dem Glasdeckglas #1,5 (oder 0,17 mm Dicke), das in der 6-Well-Platte mit Poly-D-Lysin vorbeschichtet wurde.
2. Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser mit Neuronen mit einer Pinzette und legen Sie sie vorsichtig auf die Objektträger.
3. Entfernen Sie überschüssiges Medium/Flüssigkeit mit feinen Arbeitstüchern. Falten Sie die Tücher zweimal und legen Sie sie vorsichtig auf das Deckglas. Drücken Sie die Tücher vorsichtig nach unten, ohne das Deckglas zu bewegen.
ACHTUNG: Drücken Sie das Deckglas nicht mit Gewalt gegen den Glasschieber. Mit diesem Schritt soll sichergestellt werden, dass sich das Deckglas während der Bildaufnahme nicht durch Auftriebskräfte bewegt/driftet.
4. Legen Sie Deckgläser und Objektträger mit dem Deckglas nach unten auf den Dekonvolutionsmikroskoptisch und befestigen Sie sie richtig. Mit diesem Schritt soll sichergestellt werden, dass die Position der Folie konstant bleibt, damit Benutzer später denselben Satz von Zielzellen verfolgen können.
5. Beobachten Sie WT- und CCR5-/- hypothalamische Neuronenzellen mit einer 60x/1,42 NA Öl-Immersionsobjektivlinse.
6. Behandeln Sie die ausgewählten Zellproben eine Minute lang mit CCL5 (10 ng/ml) oder Insulin (10 μl/ml). Geben Sie 1,5 μl verdünntes Insulin auf den Rand des Deckglases.
7. Visualisieren und erfassen Sie die ausgewählten Zellproben sofort. Programmieren Sie die Videoaufzeichnungssoftware so, dass sie 30 Minuten lang aufzeichnet.
2. Dekonvolutionsmikroskopie und -analyse
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls erfordert die Verwendung eines Dekonvolutionsmikroskops und einer speziellen Software für die Analyse.
1. Schalten Sie das Bildgebungssystem ein, lassen Sie den Mikroskoptisch ordnungsgemäß initialisieren und schalten Sie dann die LED-Lichtquelle ein.
2. Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 für lebende Proben bei 37 °C) auf ein Objektiv mit 60 x 1,42 NA geben. Legen Sie den Objektträger mit dem Deckglas in Richtung Objektiv auf das Mikroskop und befestigen Sie den Objektträger richtig.
3. Verwenden Sie Hellfeld- oder Fluoreszenzbeleuchtung, um Zielzellen zu identifizieren. Passen Sie den Fokus an, bis die Zielzellen deutlich zu erkennen sind. Bewegen Sie die Objektivlinse nicht außerhalb des Deckglasbereichs, um unnötige Kratzspuren zu vermeiden.
4. Identifizieren Sie den grünen Fluoreszenzprotein-konjugierten Glukosetransporter 4 (GFP-GLUT4) anhand des GFP-Signals. Identifizieren Sie die gewünschten Zielzellen für die Bildaufnahme. Die ausgewählte Position der Zielzelle kann für zukünftige Referenzen gespeichert werden (siehe Abbildung 1).
5. Richten Sie auf jeder Zielzelle die richtigen experimentellen Parameter (einschließlich Pixelanzahl, Anregungswellenlänge, Transmissionsprozentsatz, Belichtungszeit, Stapeldicke, Zeitintervall und Gesamtbildgebungszeit) ein. Für dieses Experiment wurde die Pixelzahl des Bildes für GFP-Signale auf 512 x 512 eingestellt (sie kann für eine höhere Auflösung auf 1.024 x 1.024 eingestellt werden). Die Belichtungszeit wurde zwischen 0,025 und 0,05 s pro 5 min eingestellt. Kleinere seitliche x-, y- und z-Anpassungen können mit der empfohlenen Software gesteuert werden (siehe Materialtabelle).
6. Stellen Sie den Belichtungsparameter auf ca. 2.000 bis 3.000 Zählungen ein, um die maximale Pixelintensität zu erreichen. Um das Fluoreszenz-Photobleichen zu minimieren, reduzieren Sie den Prozentsatz der Anregungslichtdurchlässigkeit so weit wie möglich und halten Sie die Belichtungszeit auf weniger als 1 s. Wiederholen Sie diese Schritte für jeden weiteren Fluoreszenzkanal und jeden einzelnen interessierenden Bereich.
7. Legen Sie die obere und untere Grenze des Z-Stapels für jede Zielzelle fest. Dies kann erreicht werden, indem der Mikroskoptisch so lange bewegt wird, bis sowohl die Ober- als auch die Unterseite der Zielzelle leicht unscharf sind. Der Benutzer kann die Auflösung der Z-Achse anpassen, indem er die Anzahl der Bilder zwischen der oberen und unteren Grenze einstellt (was durch Festlegen des Abstands zwischen den einzelnen Bildern erfolgen kann).
8. Stapel von Bildern wurden entfaltet und später mit Hilfe der entsprechenden Software – in diesem Fall Velocity von PerkinElmer – analysiert.
