Mikroskopische Analyse von Synapsen in Hippocampusschnitten der Maus mittels Immunfluoreszenz

Abstract

Quelle: McLeod, F., et al. Bewertung der Synapsendichte in Hirnschnitten von Hippocampus-Nagetieren. J. Vis. exp. (2017).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Visualisierung synaptischer Marker in hippokampalen Hirnschnitten mittels konfokaler Immunfluoreszenzanalyse. Die Scheiben werden mit primären Antikörpern immungefärbt, die auf präsynaptische und postsynaptische Marker abzielen, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern. Die markierten Marker werden dann mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie visualisiert, um die synaptische Architektur durch ihre Kolokalisation zu bewerten.

Protocol

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Acute Hippocampal Slice Preparation

1. Entfernen Sie das Gehirn der Maus so schnell wie möglich, indem Sie den Schädel mit einem Spatel und einer scharfen Schere durchtrennen und in eiskalte, sauerstoffreiche (95% O₂, 5% CO₂), künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, ~100 mL) mit hohem Saccharosegehalt legen.
2. Platzieren Sie das Mausgehirn auf einer Petrischale und entfernen Sie das Kleinhirn und einen kleinen Teil der frontalen Rinde mit einem Skalpell, bevor es die Mittellinie des Gehirns hinunter halbiert.
3. Platzieren Sie die beiden Hemisphären auf der Seite, die gerade geschnitten wurde, und kleben Sie jede Hemisphäre auf die Bühne eines Vibratoms.
4. Schneiden Sie 200 - 300 μm dicke Abschnitte des gesamten interessierenden Bereichs. Im Falle des Hippocampus sollten ca. 3 - 4 Scheiben pro Hemisphäre gewonnen werden.
5. Übertragen Sie die Scheiben mit einer Pasteur-Plastikpipette in eine Kammer, die in sauerstoffhaltiges (95% O₂, 5% CO₂) ACSF getaucht ist. 30 Min. bei 34 °C halten.
   HINWEIS: In diesem Stadium können Scheiben mit aktiven pharmakologischen Wirkstoffen, wie z.B. rekombinanten Dickkopf-1 (Dkk1) Proteinen, behandelt werden, indem die Wirkstoffe in die Schnittkammer gegeben werden.
6. Entferne mit einem Pinsel die Scheiben aus der Kammer, lege sie in eine 24-Well-Platte und fixiere sie für 20 min bis 1 h in 4% Paraformaldehyd (PFA)/4% Saccharose bei Raumtemperatur (RT).
   Achtung: PFA ist giftig, tragen Sie angemessenen Schutz.
7. Waschen Sie die Scheiben dreimal in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, je 10 min).
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier für 1 - 2 Tage pausiert werden, solange die Scheiben in 1X PBS bei 4 °C gehalten werden.

2. Immunfluoreszenz für synaptische Marker

HINWEIS: Die Rezepte aller verwendeten Puffer finden Sie in Tabelle 1.

1. Ersetzen Sie in den Slice-Wells den PBS durch blockierenden/permeabilisierenden Puffer (Tabelle 1) und inkubieren Sie bei RT für 4 - 6 Stunden.
2. Verdünnen Sie den polyklonalen Meerschweinchen-Antikörper gegen den vesikulären Glutamattransporter 1 (vGlut1) in einer Verdünnung von 1:2.000 in Blockierungs-/Permeabilisierungspuffer.
   HINWEIS: vGlut1 ist ein Marker für die präsynaptische exzitatorische Terminalvisualisierung. Zur Identifizierung der postsynaptischen exzitatorischen Synapse verwenden Sie einen polyklonalen Antikörper gegen postsynaptische Dichte-95 (PSD-95) und verdünnen Sie ihn 1:500 in derselben Lösung. Verwenden Sie ein Mindestvolumen von 300 μl in jeder Vertiefung. Um die anatomische Lage des Hippocampus zu identifizieren, verwenden Sie einen Antikörper, der auch die neuronale Struktur identifizieren kann, wie z. B. das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (MAP2) oder Tubulin. Ermitteln Sie die korrekten Konzentrationen aller Primärantikörper für die synaptischen Marker Ihrer Wahl (prä- und postsynaptisch) und verdünnen Sie sie in frischem blockierendem/permeabilisierendem Puffer.
3. Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht (oder 1 - 2 Tage) bei 4 °C in der primären Antikörperlösung. Verwenden Sie eine Schüttelplattform mit kräftigen Bewegungen.
4. Waschen Sie die Scheiben dreimal in PBS (jeweils 10 Minuten).
5. Verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper 1:500 im Blockierungspuffer. Wenn Sie beispielsweise den vGlut1-Meerschweinchen-Antikörper verwenden, wenden Sie einen sekundären Antikörper an, der die Meerschweinchenkomponente (z. B. Esel-Anti-Meerschweinchen) erkennt, die an ein spezifisches Fluorophor konjugiert ist. Wenn Sie den PSD-95-Kaninchen-Antikörper verwenden, wenden Sie einen sekundären Antikörper an, der die Kaninchenkomponente (z. B. Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper) erkennt, die an ein anderes spezifisches Fluorophor konjugiert ist.
6. Inkubieren Sie die Scheiben in dieser Lösung für 2 - 3 Stunden bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben vor Licht geschützt sind, da sekundäre Antikörper lichtempfindlich sind.
7. Waschen Sie die Scheiben dreimal in PBS (jeweils 10 Minuten).
8. Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben mit einem Pinsel von der 24-Well-Platte und platzieren Sie sie gleichmäßig auf vorbeschrifteten Glasobjektträgern. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf jede Scheibe und legen Sie dann vorsichtig ein Deckglas auf die Scheiben. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Achten Sie darauf, ausreichend Eindeckmedium (300-400 μL) zu verwenden, da eine zu geringe Menge zu trockenen Scheiben führen kann.
9. Mindestens 1 - 2 Tage bei RT trocknen lassen und die Dias vor Licht schützen.
10. Lagern Sie die Folien kurzfristig bei 4 °C, aber für die Langzeitlagerung bewahren Sie sie bei -20 °C auf.

3. Konfokale Bildaufnahme und -analyse

1. Bildgebung mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.
   1. Identifizieren Sie die Region des Hippocampus, die abgebildet werden soll (z.B. die Cornu ammonis 1 und 3 (CA1, CA3) oder der Gyrus dentatus (DG)) mittels eines 10x- oder 20x-Objektivs.
   2. Wechsle zu einem 40x oder 63x Öl-Immersionsziel, um sicherzustellen, dass die Scheibenanatomie intakt ist, indem kontinuierliche Neuriten und organisierte Strukturen identifiziert werden. Verwenden Sie einen neuronalen Marker, z. B. MAP2, als Referenz (Abbildung 1A).
   3. Wechseln Sie anschließend zu einem 60-fachen Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur [NA] = ~1,3 - 1,4) und passen Sie die Einstellungen für jeden Kanal an, um ein optimales Signal und einen optimalen Kontrast zu erhalten. Verwenden Sie eine Option für hohen/niedrigen Kontrast, um die Intensität jedes Lasers einzustellen und die Sättigung von Pixeln zu vermeiden.
      HINWEIS: Diese Einstellungen hängen vom verwendeten Mikroskop ab, beziehen Sie sich jedoch auf die Materialtabelle für die Einstellungen für die Laserleistung. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixel verwenden. Die Einstellungen sollten unter den verschiedenen Bedingungen desselben Experiments konstant bleiben. Bei Bedarf kann ein zusätzlicher Zoom angewendet werden.
   4. Bewerten Sie die Tiefe, in der die Färbung gleichmäßig ist, und erfassen Sie Bildstapel von mindestens 8 äquidistant (250 nm) Ebenen. Nehmen Sie dann 3 benachbarte repräsentative Bildstapel aus demselben Interessenbereich pro Slice.
      HINWEIS: Die Tiefe kann von Schicht zu Schicht variieren, sollte aber immer etwa 2 - 5 μm von der Oberfläche der Schicht entfernt sein.
   5. Wiederholen Sie die Erfassung in mindestens 3 Schichten pro Bedingung und von 6 - 8 Tieren pro Behandlungsgruppe.

Tabelle 1: Puffer für die Immunfluoreszenzfärbung.

KH₂PO₄

Blocking/permeabilizing Buffer	Konzentration	Notizen
Donkey serum	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH bis 7.4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% Saccharose		pH bis 7.4
PBS	1x	Verdünnen von 10x
PFA	1.33 M<
Saccharose	117 mM

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Results

Tabelle 1: Puffer für die Immunfluoreszenzfärbung.

Blockierender/permeabilisierender Puffer <td style='border:1.0pt solid black;padding:5.0pt;vertical-align:top;width:156.0pt;'>

Materials