Konfokale Bildgebung der mitochondrialen Bewegung in Oligodendrozyten in organotypischen Hirnschnittkulturen

Zusammenfassung

Quelle: Kennedy, L. H., et. al. Visualisierung und Live-Bildgebung von Oligodendrozyten-Organellen in organotypischen Hirnschnitten mittels Adeno-assoziierter Virus- und Konfokalmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Bildgebung von Oligodendrozyten-Mitochondrien in organotypischen Schnitten des Gehirns von Mäusen. Die Scheibe wird in eine Badekammer mit kontinuierlicher Flüssigkeitszirkulation und kontrollierter Temperatur gelegt. Nach dem Einstellen verschiedener Parameter des konfokalen Mikroskops werden Zeitrafferaufnahmen von Mitochondrien mit roter Fluoreszenz aufgenommen, gefolgt von Z-Stapel-Bildern des Oligodendrozyten mit grüner Fluoreszenz.

Protokoll

1. Zubereitung von organotypischen Scheiben

HINWEIS: Dieses Rezept verwendet zwei Mäusebabys am postnatalen Tag 7-9 (p7-9), was 24 organotypische Scheiben ergibt, die auf zwei Sechs-Well-Kulturschalen aufgeteilt sind. Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Eingriffe in einer sterilen Haube durchgeführt werden, und es sollten Nitril- oder Latexhandschuhe verwendet werden. Es sollten nur Inhaltsstoffe in Zellkulturqualität verwendet werden.

1. Für die Schnittvorbereitung wurden Autoklavenflaschen, Sezierwerkzeuge (1 große Schere, 1 kleine Schere, 1 großer flacher Spatel, 1 kleiner abgerundeter und geschärfter Spatel und 1 Pinzette; siehe Materialliste für Details), Glaspipetten, Pipettenspitzen und Gewebetücher verwendet.
2. Da die Hälfte der Glaspipetten mit der großen Öffnung verwendet werden sollte, brechen Sie das schmale Ende ab.
   1. Ritzen Sie mit einem Diamant-Ritzstift (falls vorhanden) um die Pipette herum, knapp unter der Stelle, an der sich das Glas zu verengen beginnt. Legen Sie dann das spitze Ende der Pipette in einen Nitrilhandschuh oder ähnliches. Brechen Sie die Spitze vorsichtig ab, indem Sie die Pipette biegen, während Sie sie gegen eine Werkbank drücken.
   2. Reiben Sie dann das abgebrochene Ende ab, indem Sie es auf einem Stück Schleifpapier reiben oder auf einem Bunsenbrenner leicht schmelzen. Die gebrochenen Pipetten werden zum Übertragen von geschnittenen Hirnschnitten verwendet, wobei das abgebrochene Ende in den Gummikolben verwandelt wird und das große offene Ende die Lösung/Scheiben berührt.
      HINWEIS: Dies wird nicht in einer sterilen Haube durchgeführt und kann mehrere Tage im Voraus durchgeführt werden.
3. Kulturgerichte zubereiten.
   HINWEIS: Dies kann am Tag vor dem Schneiden oder mindestens 2 Stunden vor dem Schneiden erfolgen.
   1. Sterilisieren Sie Membranen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) ("Konfetti"). Entferne mit zwei sterilen Pinzetten ein einzelnes Konfetti von den umliegenden blauen Plastikstücken. Sterilisieren Sie dann, indem Sie zweimal in eine Petrischale mit 96 % Ethanol (EtOH) eintauchen. Legen Sie das Konfetti dann zum Trocknen flach in eine sterile große Petrischale.
      HINWEIS: Das Konfetti besteht aus hydrophilen PTFE-Membranen, ähnlich den Membranen in den Kultureinsätzen. Die Verwendung von Konfetti unterstützt die Live-Bildgebung, da einzelne Scheiben einfach vom Einsatz auf das Mikroskop übertragen werden können, indem das Konfetti mit einer Pinzette angehoben wird (siehe 4.8. für Details). Alternativ können die Gehirnschnitte ohne Konfetti kultiviert werden (bei dem die Scheiben direkt an der Membran des Kultureinsatzes haften). In diesem Fall muss der Membraneinsatz mit einem Skalpell geschnitten werden, um die Scheibe in das Mikroskopbad zu überführen.
   2. Geben Sie 1 ml Nährmedium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Kulturschalen.
   3. Setzen Sie mit einer sterilen Pinzette einen Kultureinsatz in jede Vertiefung ein. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Einsatz und dem Nährmedium.
      HINWEIS: Um Geld zu sparen und die Umwelt zu schonen, ist es möglich, die Kultureinsätze wiederzuverwenden. Dies kann durch gründliches Spülen in destilliertem Wasser (dH₂O) erfolgen, gefolgt von einer Inkubation in 70% EtOH für mindestens 24 Stunden bis zur Wiederverwendung. Bei der Vorbereitung einer neuen Kultur trocknen Sie die Einsätze in einer Zellkulturplatte unter ultraviolettem (UV) Licht für 15-30 min.
   4. Geben Sie jeweils zwei (sterilisierte und trockene) Konfetti auf jeden der Kultureinsätze. Platzieren Sie das Konfetti an den Rändern der Einsätze, um eine minimale Überlappung zu erhalten.
   5. Stellen Sie die Platten bei 37 °C mit 5 % CO₂ in den Zellkultur-Inkubator.
4. Blasenkaltdissektionsmedium mit Bioxidgas (95% O₂/5%CO₂). Um die Lösung steril zu halten, verbinden Sie den Schlauch von der Gasflasche mit einem sterilen Spritzenvorsatzfilter (0,22 μm Porengröße).
   1. Koppeln Sie das andere Ende des Spritzenvorsatzfilters an ein steriles Röhrchen, das mit einer sterilen Glaspipette verbunden ist. Legen Sie die Glaspipette in die Lösung, bedecken Sie sie mit Parafilm und schalten Sie das Gas ein. Bewahren Sie das Seziermedium auf Eis auf.
5. Bereiten Sie den Sezier-/Schneidebereich vor.
   HINWEIS: Idealerweise sollte dieser Eingriff in einer sterilen Haube durchgeführt werden. Ist dies nicht möglich, kann das Vibratom auf einer Werkbank belassen werden. In diesem Fall wird empfohlen, ein Haarnetz und eine Gesichtsmaske zu verwenden.
   1. Schneiden Sie mit einer einschneidigen Rasierklinge ein rechteckiges Stück (ca. 2 cm x 0,5 cm) Agarose-Gel aus und kleben Sie es so auf den Vibratom-Tisch, dass die lange Seite zur Vibratom-Klinge zeigt.
   2. Reinigen Sie alle Oberflächen und die Vibrationsteile mit 70% EtOH und wischen Sie sie mit autoklavierten Tüchern ab.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass alle Teile, die mit dem Gehirngewebe in Berührung kommen, vollständig trocken sind, da EtOH die Zellen schädigen kann.
   3. Befestigen Sie eine sterile Rasierklinge an dem Vibratom und führen Sie eine Vibrationsprüfung durch, um festzustellen, ob das Vibratom diese Funktion hat.
   4. Legen Sie autoklavierte Sezierwerkzeuge, autoklavierte Gewebetücher, vier kleine Petrischale, ein Skalpell mit runder Kante, zwei Glaspipetten mit Gummikugeln, zwei Glaspipetten mit offenem Ende (siehe Pkt. 1.1) und Sekundenkleber (mit EtOH besprüht) in die Haube.
   5. Gießen Sie das sprudelnde Seziermedium in das Vibratomchen und in die vier kleinen Petrischale.
      HINWEIS: Dieser Schritt sollte nur unmittelbar vor der Sektion durchgeführt werden, da das Medium von diesem Zeitpunkt an nicht mehr blasig oder auf Eis gehalten wird.
6. Gehirne sezieren und bestücken.
   HINWEIS: Um gesunde Scheiben zu erhalten, muss dieser Schritt schnell und präzise durchgeführt werden. Es braucht etwas Übung.
   1. Tier #1 durch Verrenkung des Halses oder nach örtlichen Richtlinien einschläfern und dann mit der großen Schere enthaupten.
   2. Entfernen Sie mit einer kleinen, scharfen Schere schnell die Haut, indem Sie einen sagittalen Schnitt vom Hals bis zur Nase machen und zur Seite ziehen, um den Schädel freizulegen.
      1. Entlang der sagittalen Naht schneiden, gefolgt von seitlichen Schnitten über dem inneren Teil der Stirnknochen und der Lamboidnaht (der Grenze zwischen Großhirn und Kleinhirn).
      2. Biege den Schädel auf jeder Seite mit einer Pinzette auf. Die Hirnnerven werden vom Gehirn abgeschnitten, indem ein abgerundeter, scharfer Spatel unter die ventrale Seite des Gehirns eingeführt und der Spatel sanft seitlich bewegt wird.
   3. Verwende eine einschneidige Rasierklinge, um einen koronalen Schnitt rostral zum Kleinhirn zu machen.
      HINWEIS: Dieser Schnitt bestimmt den Winkel, in dem die Scheiben geschnitten werden. Es sollte daher in einem geraden Winkel ausgeführt werden.
   4. Drehen Sie das Gehirn aus dem Schädel in eine kleine Petrischale, in der sich ein Seziermedium befindet.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.1. - 1.6.4. für Tier #2 und platzieren Sie dieses Gehirn in einer zweiten Petrischale.
      HINWEIS: Die Tiere sind nicht steril. Führen Sie die Dissektion auf einer Seite der Haube durch und gehen Sie dann zur anderen, sauberen Seite, sobald das Gehirn aus dem Schädel entfernt wurde.
   6. Handschuhe wechseln.
   7. Befestigen Sie das Gehirn an der Vibratom-Bühne: Tragen Sie eine dünne Schicht Sekundenkleber auf die Bühne direkt vor dem montierten Agarose-Gel auf. Halten Sie Gehirn #1 mit einem großen, flachen Spatel, wobei die frisch geschnittene (kaudale) Seite den Spatel berührt und die ventrale Seite dem Agarosegel zugewandt ist (und so nah wie möglich daran ist).
      1. Lege dann das Gehirn vorsichtig auf den Kleber, indem du es mit einer Pinzette vom Spatel schiebst. Achte darauf, genügend Platz für Gehirn #2 zu lassen.
         HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Gehirn gut an der Bühne befestigt ist, aber ohne übermäßigen Kleber, da dies den Schnitt behindern kann.
   8. Unmittelbar nach der Montage von Gehirn #1 verwenden Sie den großen Spatel, um einige Tropfen Seziermedium auf das Gehirn aufzutragen. Dies hält das Gehirn feucht, härtet den Kleber aus und verhindert, dass er an den Seiten des Gehirns klebt.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 1.6.7 und 1.6.8. Für das Gehirn #2.
   10. Befestigen Sie die Bühne auf dem Vibratomenboot.
7. Schneiden Sie 230 μm dicke koronale Scheiben mit einer Amplitude von 1 - 1,5 mm, einer Frequenz von 85 Hz und einer Geschwindigkeit von 0,2 mm/s. Sammeln Sie Scheiben zwischen 1,4 mm rostral und 2,1 mm kaudal zu Bregma.
   1. Nach dem Schneiden jeder Scheibe mit offenen Glaspipetten wird die Scheiben aufgefangen (Abschnitt 1.1). Die Scheiben in eine Petrischale geben, die ein Seziermedium enthält. Schneide die Scheiben mit einem abgerundeten Skalpell in zwei Stücke und teile die beiden Halbkugeln.
8. Wenn alle Scheiben geschnitten sind, die Scheiben in die Kulturschalen legen.
   1. Nehmen Sie die Kulturschale (eine nach der anderen) aus dem Inkubator.
   2. Mit den offenen Glaspipetten vorsichtig eine Scheibe auf jedes Konfetti geben.
      HINWEIS: Die Scheiben sollten flach in der Mitte des Konfettis liegen. Das erfordert etwas Geschick. Wenn jedoch einige Scheiben nicht perfekt sind, ist es besser, sie stehen zu lassen, als Zeit damit zu verbringen, sie zu bewegen, da es wichtig ist, alle Scheiben so schnell wie möglich in den Inkubator zu bekommen.
   3. Verwenden Sie eine Glaspipette (spitzes Ende), um überschüssiges Medium vorsichtig zu entfernen, ohne die Scheibe zu berühren.
      HINWEIS: Scheiben sollten während der Inkubation nicht in Flüssigkeit getaucht werden. Daher muss das überschüssige Medium so abgesaugt werden, dass die Scheiben der Luft ausgesetzt sind (ein dünner Mediumfilm bedeckt die Scheiben noch). Scheiben, die in der Flüssigkeit verbleiben, sind in der Regel ungesund oder sterben ab (4 und unsere Beobachtungen).
   4. Schieben Sie die Schale zurück in den Inkubator, sobald das gesamte Konfetti eine Scheibe hat.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.7.8. - 1.8.4. Für Gericht #2.
9. Wechseln Sie das Kulturmedium.
   HINWEIS: Dies sollte am Tag nach dem Schneiden (Tag 1 in vitro, DIV1) und dann alle 2-3 Tage erfolgen.
   1. Heizen Sie das Nährmedium in einem Wasserbad oder im Inkubator vor.
   2. Verwenden Sie in einer sterilen Haube eine Vakuumabsaugung oder eine normale Pipette mit steriler Spitze, um Kulturmedium aus jeder Vertiefung zu aspirieren. Dies geschieht, indem die Schale vorsichtig (um ca. 30 Grad) gekippt und die Pipettenspitze an den Rand des Kultureinsatzes gelegt wird.
   3. Entfernen Sie ca. 800 μl aus jeder Vertiefung (es bleibt gerade genug Medium übrig, um den Boden des Einsatzes mit Medium bedeckt zu halten). Geben Sie dann mit einer sauberen Pipette 800 μl des vorgewärmten Mediums in jede Vertiefung. Stellen Sie dann die Schalen wieder in den Zellkultur-Inkubator.

2. Virale Transduktion

1. Kaufen oder stellen Sie Adeno-assoziierte Viren (AAVs) mit einem Plasmid von Interesse her.
   HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des AAV-Serotyps 2/8 (AAV 2/8), der mitochondrial zielgerichtetes dsred oder GFP trägt, als Reportergen unter der transkriptionellen Kontrolle des Myelin-Basisprotein-Promotors12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred oder AAV2/8 MBP_mito_GFP) zur Visualisierung von Oligodendrozyten-Mitochondrien. AAV 2/8, das GFP oder Tdtomato als Reportergen trägt, das vom allgemeinen CAG-Promotor (AAV 2/8 CAG_GFP oder AAV 2/8 CAG_tdtomato) gesteuert wird, wird zur Visualisierung des Zytoplasmas von Oligodendrozyten verwendet. So ergibt die Kombination von AAV2/8 MBP_mito_dsred mit AAV 2/8 CAG_GFP rote Mitochondrien und grünes Zytoplasma in Oligodendrozyten, während die Kombination von AAV2/8 MBP_mito_GFP und AAV 2/8 CAG_tdtomato grüne Mitochondrien und rotes Zytoplasma ergibt. Die Konstrukte werden an anderer Stelle ausführlicher beschrieben13.
2. Am Tag 7 in vitro (DIV7) werden Oligodendrozyten mit den AAVs transduziert.
   VORSICHT: Befolgen Sie die Sicherheitsvorschriften, wenn Sie mit AAVs arbeiten. Stellen Sie sicher, dass Sie über die richtige Schulung und die erforderliche Zulassung der Biosicherheitsstufe verfügen. Alle folgenden Punkte sollten in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II mit Handschuhen und Laborkittel durchgeführt werden. Hier wird die Anwendung von AAV auf den Cortex-Bereich der Scheiben beschrieben, da dies der Bereich ist, der die beste Erholung zeigt.
   1. Verdünnen Sie das AAV in einem vorgewärmten (37 °C) Nährmedium. Verdünnungen um 2 × 10⁹ Genomkopien/ml (GC/ml) werden empfohlen, um eine spärliche Transduktion von Oligodendrozyten zu erhalten, die die Abbildung einzelner Zellen innerhalb der Scheibe ermöglicht. Es sollte jedoch ein Pilotprojekt mit unterschiedlichen Titern durchgeführt werden, um eine Dichte der transduzierten Oligodendrozyten zu gewährleisten, die für die spezifischen Experimente geeignet ist. Wenn zwei verschiedene AAVs verwendet werden, sollten diese in derselben Lösung gemischt und gleichzeitig in die Scheibe gegeben werden.
   2. Geben Sie etwa 1,3 μl verdünntes AAV zu jeder Scheibe. Stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Pipettenspitze trocken ist. Pipettieren Sie 1,3 μl verdünntes AAV und halten Sie die Pipette so nah wie möglich über die Rinde, ohne die Scheibe mit der Pipettenspitze zu berühren (ca. 1 mm entfernt).
   3. Drücken Sie dann langsam die Lösung aus der Pipette. Wenn die Lösung die Scheibe berührt, bewegen Sie die Pipettenspitze über die Rinde, um die Lösung über den gesamten Rindenbereich zu verteilen.
      HINWEIS: Dieser Vorgang sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass die Scheiben länger als nötig aus der Haube herausgehalten werden. Tun Sie dies auf einer Schale nach der anderen und stellen Sie die erste Schale wieder in den Inkubator, bevor Sie mit Gericht #2 beginnen. Um eine zufriedenstellende Verteilung von AAV zu erreichen, ohne das Gewebe zu schädigen, bedarf es einiger Übung und einer ruhigen Hand.
3. Steht im Zelllabor ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop zur Verfügung, kann die Proteinexpression während der Zeit in Kultur überprüft werden, indem die Schale unter das Mikroskop gelegt wird.
   HINWEIS: Die Schale sollte nicht länger als 2 - 5 Minuten außerhalb des Inkubators aufbewahrt werden.

3. Zeitraffer-Bildgebung

HINWEIS: Die Bildgebung kann immer dann durchgeführt werden, wenn die Expressionspegel der Fluoreszenzmarker ausreichend sind und die Schichten gesund aussehen (normalerweise DIV11-14).

1. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop, die Perfusion und die Heizung richtig eingerichtet sind, damit die blasenförmige Bildgebungslösung erhitzt wird und in das Bad ein- und austreten kann.
   HINWEIS: Es gibt verschiedene Lösungen für Badekammern. Eine einfache Version wird hier vorgestellt.
   1. Ein- und Auslässe der Badewanne werden mit abgestumpften Spritzennadeln (um ~45° gebogen) hergestellt, die mit Blu-Tack/Fun Tack an den Seiten der Badewanne befestigt sind.
   2. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch von einer Flasche mit kontinuierlich blasenförmiger Bildgebungslösung über die Peristaltikpumpe durch das Heizrohr der Heizeinheit und dann zur Einlassspritzennadel im Bad geleitet wird.
   3. Schließen Sie einen weiteren Schlauch an den Auslass der Spritzennadel an. Dieser Schlauch gelangt dann über die Peristaltikpumpe zurück in die Flasche mit der Bildgebungslösung (oder in eine Abfallflasche).
2. Bubble-Imaging-Lösung mit Bioxidgas.
   HINWEIS: Dies sollte mindestens 15 Minuten vor der Bildgebung begonnen und während des gesamten Experiments fortgesetzt werden.
3. Schalten Sie die Schlauchpumpe und die Heizung ein und lassen Sie die Lösung durch das Bad laufen, um eine optimale Badtemperatur (37 ± 0,5 °C) zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass der an die Temperatureinheit angeschlossene Thermometersensor in die Badlösung eingetaucht ist.
4. Schalten Sie das Mikroskop, die Fluoreszenzlampe und die entsprechenden Laser ein.
5. Stellen Sie einen geeigneten Lichtweg für die Probe ein.
   HINWEIS: Dies hängt vom Mikroskop-Setup und der Sonde ab. Allgemeine Kenntnisse im Umgang mit dem Konfokalmikroskop sind erforderlich und werden hier nicht behandelt.
6. Verwenden Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit der entsprechenden Vergrößerung und numerischen Apertur (n.a.). Wir verwenden ein 40x Wasserimmersionsplan-Apochromat-Objektiv (n.a. 1,0).
7. Offene Lochblende, um einen optischen Schnitt von ca. 2 - 2,5 μm für das Zeitraffervideo zu erzielen. Dies reduziert das Auftreten von Mitochondrien, die sich während des Zeitraffers unscharf bewegen.
8. Organotypische Scheibe in das Bad geben:
   1. Einen Tropfen Bildgebungslösung oder Kulturmedium in eine kleine Petrischalen aus Kunststoff geben.
   2. Verwenden Sie in einer sterilen Haube eine sterile Pinzette, um eine organotypische Scheibe vom Membraneinsatz auf den Tropfen zu übertragen. Die Pinzette sollte nur das Konfetti berühren und nicht die Scheibe.
   3. Setze den Deckel auf die Petrischale.
   4. Stellen Sie die Kulturschale mit den restlichen Scheiben sofort wieder in den Inkubator.
   5. Bringen Sie eine Petrischale, in der sich die Scheibe befindet, zum Mikroskop.
   6. Schalten Sie die Peristaltikpumpe aus, während Sie die Scheibe in das Mikroskopbad übertragen. Heben Sie zuerst mit einer Pinzette das Konfetti mit einer Scheibe aus der Petrischale an die Oberseite der Badewanne (das Konfetti schwimmt). Platzieren Sie dann die beiden Spitzen der Pinzette auf jeder Seite des Konfettis, so dass sie das Konfetti berühren, ohne die Scheibe zu berühren, und schieben Sie das Konfetti durch die Lösung auf den Boden des Bades. Zentriere das Konfetti in der Mitte der Badewanne.
   7. Lege mit einer Pinzette den Festhalteanker (Harfe) auf das Konfetti, ohne die Scheibe zu berühren.
      HINWEIS: Eine Harfe ist ein hufeisenförmiger Platinanker, der verwendet wird, um zu verhindern, dass die Scheibe in der Badewanne schwimmt oder driftet. Bei spitzen Schnitten verlaufen dünne Saiten von einer Seite der Harfe zur anderen (ähnlich einer Musikharfe). Bei organotypischen Scheiben sollte die Harfe fadenlos sein und so an die Größe des Konfettis angepasst sein, dass sie auf dem Konfetti liegen kann, ohne die Scheibe zu berühren.
   8. Schalten Sie die Schlauchpumpe wieder ein.
9. Senken Sie das Objektiv bis zur Probe ab.
10. Wählen Sie die Zelle und den Bereich aus, die abgebildet werden sollen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Exposition der Zellen gegenüber Laserlicht, da dies zu Zelltoxizität führen kann (siehe Tipps in den folgenden Punkten).
    1. Verwenden Sie die Okulare und die Leuchtstofflampe, um einen gesund aussehenden Oligodendrozyten mit dem richtigen Ausdruck zu finden. Typischerweise erscheinen Oligodendrozyten, die eine starke Überexpression des fluoreszierenden Proteins aufweisen, als ungesund. Ungesunde Oligodendrozyten haben Prozesse mit einem klecksigen Aussehen, und die Mitochondrien erscheinen fragmentiert. In gesunden Oligodendrozyten erscheinen das Soma und die Fortsätze glatt, und die Mitochondrien haben unterschiedliche Längen (obwohl sie typischerweise viel kürzer sind als bei Neuronen und Astrozyten).
    2. Platzieren Sie die interessierende Zelle in der Mitte des Sichtfelds.
    3. Verwenden Sie die "Live"-Funktion in der Software (für Leica- und Zeiss-Mikroskope), um die Zelle auf dem Bildschirm zu identifizieren und einen Bereich von Interesse auszuwählen, z. B. einen Teil der Zelle, der mehrere Primärfortsätze oder Myelinscheiden enthält, oder einen einzelnen Prozess oder eine Myelinscheide.
       HINWEIS: Um so viel wie möglich von den Prozessen/Hüllen abbilden zu können, wählen Sie Bereiche mit Prozessen, die relativ flach in x-y-Richtung liegen.
    4. Vergrößern Sie das Interessenfeld (in der Regel wird ein Bild mit einer Pixelgröße von 0,14 - 0,30 μm erzeugt).
    5. Zeichnen Sie mit dem Werkzeug "Regionen" ein Rechteck um den Bereich und wählen Sie die Option, nur den ausgewählten Bereich zu scannen. Die Scanzeit und damit die Laserbelichtung wird reduziert, indem nur der ausgewählte Bereich gescannt wird.
       HINWEIS: Horizontale rechteckige Bereiche werden aufgrund der geringeren Anzahl gescannter Zeilen schneller gescannt als vertikale Bereiche. Wenn ein vertikaler Rechteckbereich gescannt wird, kann die Scanzeit verkürzt werden, indem das Scanfeld um 90 Grad gedreht wird (mit dem Rotationswerkzeug).
11. Passen Sie die Laserleistung und -verstärkung an, um eine gute Sicht auf die Mitochondrien zu erhalten.
    HINWEIS: Verwenden Sie die minimale benötigte Laserleistung. Wenn möglich, erhöhen Sie die Verstärkung, anstatt die Laserleistung zu erhöhen. Eine zu hohe Laserleistung führt nicht nur zu Zelltoxizität, sondern bleicht die abgebildeten Objekte auch mit der Zeit aus, so dass eine weitere Erhöhung der Laserleistung oder -verstärkung während des Scannens erforderlich ist. Die erforderliche Laserleistung und -verstärkung hängt von der Expressionsstärke und dem Mikroskop ab. Bei einem konfokalen Mikroskop LSM700 verwenden wir einen 555-nm-Laser mit einer Leistung von 20-40 μW, um dsred oder tdtomato abzubilden, und einen 488-nm-Laser mit 20 - 30 μW zur Abbildung von GFP (Laserleistung, die an der hinteren Apertur des Objektivs gemessen wird). Die Verstärkung ist für Live-Bildgebung hoch angesetzt, normalerweise im Bereich von 700 - 800 für GFP und 850-980 für dsred und tdtomato. Die hohe Verstärkung kann zu mehr Hintergrundgeräuschen führen, die durch Erhöhen des digitalen Offsets beseitigt werden (Offset-Werte liegen typischerweise zwischen 0 und 15). Unserer Erfahrung nach ergibt die Verwendung von MBP_mito_GFP ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als MBP_mito_dsred.
12. Wählen Sie die Scangeschwindigkeit aus.
    HINWEIS: Minimieren Sie die Scanzeit, indem Sie eine hohe Scangeschwindigkeit verwenden und einen kleinen Scanbereich zeichnen (siehe Punkt 4.10.5 unten). Es ist auch möglich, Scanzeit zu sparen, indem ein bidirektionaler Scan durchgeführt wird. Dies wird jedoch aufgrund der schlechteren Bildqualität nicht empfohlen.
13. Stellen Sie die Häufigkeit und Dauer der Zeitrafferaufnahme ein, z. B. alle 2 Sekunden für insgesamt 20 Minuten Bilder für die mitochondriale Bildgebung in Oligodendrozyten.
    HINWEIS: Die Häufigkeit und Dauer sollte entsprechend der Mobilität der interessierenden Objekte eingestellt werden. Eine höhere Frequenz setzt die Probe mehr Laserlicht aus, aber sich schneller bewegende Objekte erfordern auch eine kürzere Gesamtdauer von Zeitraffervideos (z. B. werden Mitochondrien in Neuronen, die sich häufiger und mit einer viel höheren Geschwindigkeit bewegen als Mitochondrien in Oligodendrozyten, typischerweise jede Sekunde für insgesamt 2 Minuten abgebildet16).
14. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme.
    HINWEIS: Die Mitochondrien können sich während der Aufnahme unscharf bewegen und/oder aus dem abgebildeten Bereich herausdriften. Um Vibrationen und Bewegungen zu minimieren, passen Sie die Ein- und Auslässe des Bades an und reduzieren Sie bei Bedarf die Pumpendrehzahl. In der Regel kommt es immer noch zu kleinen Veränderungen im Fokus. Daher ist eine kontinuierliche Überwachung des Bildschirms während der Bildgebung erforderlich, mit kleinen Anpassungen des Fokus während der Aufnahme.

Erfassen Sie einen Z-Stack der gesamten Zelle zur zukünftigen Identifizierung der Zelle und des abgebildeten Prozesses.
HINWEIS: Für eine bessere Auflösung sollte die Lochblende für den Z-Stapel auf 1 luftige Einheit zurückgesetzt werden.

Materialien