Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der Anziehungskraft des Mikroglia-Prozesses auf eine Verbindung in einem Maushirnschnitt

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1. Zwei-Photonen-Mikroskopie

1. Parameters setting
   1. Schalten Sie das Multiphotonensystem ein (Hybriddetektoren, Laser, Scanner, elektrooptischer Modulator, Mikroskop).
   2. Stimmen Sie den Laser auf 920 nm ab, überprüfen Sie, ob der Laser modengekoppelt ist, und stellen Sie die Leistung auf 5 % - 15 % und die Verstärkung auf 10 % ein. Dies entspricht einer Leistung von 3 - 5 mW unter dem Objektiv. Es ist sicherzustellen, dass die nicht degescannten Detektoren aktiviert sind und dass die entsprechenden Emissions- und Anregungsfilter installiert sind.
   3. Stellen Sie die Parameter der Bildgebungssoftware auf folgende Werte ein: für die Bildgröße 1024 x 1024 Pixel, was einer Fläche von 295,07 x 295,07 μm entspricht; Für den Zoom 2. Wenn das Signal sehr verrauscht ist, wenden Sie einen Linienmittelwert von 2 an. Stellen Sie für die Pixeldynamik die Imaging-Software auf 12 Bit oder mehr ein.
      HINWEIS: Bilder mit einem höheren Bit-Wert ermöglichen es den Forschern, kleinere Unterschiede in der Fluoreszenzintensität zu unterscheiden als Bilder mit einem niedrigeren Bit-Wert: Eine Änderung von einem Grauwert in einem 8-Bit-Bild würde einer Änderung von 16 Grauwerten in einem 12-Bit-Bild und von 256 Grauwerten in einem 16-Bit-Bild entsprechen. Daher eignen sich Bilder mit höheren Bits besser für die quantitative Analyse, aber wenn ihre Größe mit der Bittiefe zunimmt, können die Speicherkapazität und die Rechenleistung begrenzt werden.
   4. Wählen Sie den Scan-Modus XYZT mit einem Z-Intervallbereich bei 2 μm und einem T-Intervall von 2 min.
      HINWEIS: Die x-, y- und z-Auflösung wird durch das Nyquist-Sampling-Theorem bestimmt. Eine Z-Schrittgröße von etwa 0,8 wäre optimal, um Mikrogliaprozesse aufzulösen (mit einem Durchmesser von <1 μm), aber die optische Auflösung der Multiphotonenmikroskopie ist begrenzt (bei 920 nm mit einem 0,95 NA-Objektiv liegt die axiale Auflösung bei etwa 1 μm). Zusätzlich zu dieser physikalischen Barriere kommt es bei einem Live-Imaging-Experiment auf die Empfindlichkeit oder das Signal-Rausch-Verhältnis, die Auflösung, die Geschwindigkeit und die gesamte Beobachtungszeit an. Unter Berücksichtigung all dieser Parameter wurden hier ein Z-Schritt von 2 μm, eine Bildgröße von 1024 x 1024 Pixeln und eine Hochgeschwindigkeitserfassung mit einem Resonanzscanner gewählt, der an HyD-Detektoren gekoppelt ist (es dauert etwa 15 s, um 50 z-Pläne zu erfassen). Die Häufigkeit der Erfassungen beträgt eine XYZT-Serie alle 2 Minuten, und die Gesamtdauer beträgt 30 Minuten. Wenn die Einrichtung nicht schnell oder empfindlich genug ist, ist es möglich, die laterale Auflösung (auf 512 x 512) oder die Anzahl der Z-Scheiben zu reduzieren (indem ausschließlich in der Z-Tiefe abgebildet wird, die die stärkste Fluoreszenz aufweist [d.h., nicht die tiefsten Z-Schichten, in denen die Fluoreszenz schwach ist]), oder um die Geschwindigkeit des Scanners zu verringern. Die axiale Auflösung kann auch durch Erhöhung des z-Schritts auf bis zu 3 μm verringert werden, da dies jedoch die Quantifizierung beeinträchtigen kann, sollten alle zu vergleichenden Experimente mit demselben z-Schritt durchgeführt werden.
      HINWEIS: Es ist möglich, ähnliche Experimente an Schnitten von CX3CR1creER-YFP-Mäusen durchzuführen, einer Mauslinie, die nur zur Induktion der genetischen Deletion in Mikroglia verwendet wird und in der Mikroglia konstitutiv gelb fluoreszierendes Protein (YFP) exprimieren. Das Expressionsniveau von YFP ist jedoch im Vergleich zu grün fluoreszierendem Protein (GFP) in CX3CR1 sehr gering^GFP/+ Mäuse; Somit ist die Bildgebung zwar möglich, aber anspruchsvoll und erfordert die Optimierung der Erfassungsparameter. Es wird empfohlen, sie wie folgt anzupassen.
   5. Stimmen Sie den Laser auf 970 nm ab (was besser an die YFP-Anregung angepasst ist als 920 nm), die Leistung auf 50% und die Verstärkung auf 50%, was einer Laserleistung unter dem Ziel von 5 - 6 mW entspricht.
   6. Stellen Sie einen Zeilendurchschnitt von 4 (oder mehr) ein, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
2. Positionierung der Scheibe und der Glasmikropipette und die lokale Anwendung der Verbindung
   1. Verbinden Sie die peristaltische Pumpe mit der Aufnahmekammer, 30 Minuten bevor Sie die Aufnahme starten. Nach der Reinigung des gesamten Perfusionssystems mit 50 mL Reinstwasser wird die Perfusion der Aufnahmekammer mit aCSF (50 mL) in einem Glasbecherglas unter ständiger Auffrischung gestartet. Halten Sie den zirkulierenden aCSF während des gesamten Experiments mit einem Inline-Mikroheizer oder einem Peltier-Heizer auf 32 °C.
      HINWEIS: Eine spezielle Perfusionskammer mit oberer und unterer Perfusion ist so konzipiert, dass die Sauerstoffversorgung auf beiden Seiten der Scheibe optimiert wird. Die Perfusionskammer besteht aus zwei perfekt passenden Teilen, zwischen denen ein Polyamidnetz gespannt ist (Figure 1A,B). Im Vergleich zu anderen Arten von Kammern, bei denen die Scheibe direkt auf einem Glasdeckglas liegt, reduziert diese Kammer den neuronalen Tod im unteren Teil der Scheibe, verbessert die Lebensfähigkeit und reduziert die durch ihre Schwellung induzierten Scheibenbewegungen.
   2. Übertragen Sie mit einer Weithals-Einweg-Transferpipette die abzubildende Hirnscheibe in das aCSF-Becherglas, um das Linsenpapier zu entfernen, lassen Sie sie absinken (als Nachweis, dass keine Luftblase anhaftet) und übertragen Sie sie in die Aufnahmekammer (Perfusionskammer).
   3. Positionieren Sie einen Scheibenhalter (eine Haarnadel aus Platin, bei der die beiden Äste durch parallele Nylonfäden verbunden sind) auf der Scheibe, um die Bewegung der Scheibe aufgrund des Perfusionsflusses zu minimieren.
   4. Verwenden Sie die Hellfeldbeleuchtung, um die interessierende Hirnregion (Belichtungszeit: 50 bis 80 ms) mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (5x oder 10x) anzuvisieren. Wechseln Sie zum Wasserimmersionsobjektiv mit höherer Vergrößerung (25x mit einem 0,35-fachen Objektiv) und passen Sie die Position an.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Bildfelder in der Nähe der Nylonfäden des Scheibenhalters, da diese das Licht blockieren und die Scheibe lokal verformen können. Stellen Sie sicher, dass der Interessenbereich flach ist. Entfernen Sie ggf. den Scheibenhalter, um die Scheibe und/oder den Scheibenhalter neu zu positionieren.
   5. Verwenden Sie die Fluoreszenzbeleuchtung, um fluoreszierende Mikrogliazellen zu lokalisieren, die im Feld abgebildet werden sollen (Belichtungszeit: 250 - 500 ms).
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es den Forschern, das Vorhandensein von Zellen in der interessierenden Region und ihre Fluoreszenzintensität zu überprüfen und die Menge an Zelltrümmern zu kontrollieren.
   6. Füllen Sie die Pipette mit 10 μl aCSF mit ATP, 5-HT oder dem betreffenden Arzneimittel in seiner Endkonzentration auf. Richten Sie die Spitze nach unten und schütteln Sie die mit dem Medikament gefüllte Pipette vorsichtig, um alle in der Spitze eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
      HINWEIS: Wenn die zu injizierende Lösung dazu neigt, Blasen zu bilden, sollten Sie Borosilikatpipetten mit einem internen Filament verwenden. Das Austreten von ATP aus der Pipette kann bereits vor der Injektion Mikrogliaprozesse anziehen (wenn dies geschieht, wird es im Analyseschritt sichtbar). Obwohl dies bei der verwendeten ATP-Konzentration moderat sein sollte (500 μmol·L^-1), wenn es ein Problem darstellt, sollten Sie erwägen, die Mikropipette mit 2 mL aCSF vorzufüllen, bevor Sie die ATP-Lösung (oder eine andere Verbindung) in Schritt 1.2.6 hinzufügen.
   7. Montieren Sie die gefüllte Pipette in einem Pipettenhalter, der mit einem transparenten Schlauch mit einer 5-ml-Spritze verbunden ist, wobei sich ein Kolben in der 5-ml-Position befindet. Der Pipettenhalter selbst ist auf einem dreiachsigen Mikromanipulator montiert.
   8. Positionieren Sie die Pipette bei Hellfeldbeleuchtung mit dem Mikromanipulator in der Mitte des Feldes. Für eine reproduzierbare und optimale Zentrierung zeigen Sie die Lineale auf dem Bild an und verwenden sie.
   9. Senken Sie die Pipette vorsichtig in Richtung der Scheibe, wobei Sie das Objektiv gleichzeitig steuern und einstellen, bis die Pipettenspitze die Oberfläche der Scheibe leicht berührt. Wenn Sie das Absinken der Pipette stoppen, sobald sichtbar ist, dass die Scheibe berührt wurde, kann die Pipettenspitze 80 - 100 μm der Oberfläche der Scheibe durchdringen (siehe Abbildung 2B).
   10. Stimmen Sie den Laser ab (siehe Parameter oben) und schalten Sie das Mikroskop in den Multiphotonen-Modus. Stellen Sie sicher, dass die Kammer von jeder Lichtquelle (z. B. einem Computerbildschirm) abgeschirmt ist. Schalten Sie die nicht degescannten Detektoren ein und stellen Sie die Verstärkung ein. Verwenden Sie eine Nachschlagetabelle (LUT) mit einer farbcodierten Obergrenze, um eine Sättigung der Pixel im Bild zu vermeiden.
   11. Bestimmen Sie die Dicke der abzubildenden Scheibe (d. h. die obere und untere Z-Position, an der Fluoreszenz nachweisbar ist [in der Regel insgesamt zwischen 220 und 290 μm]).
       HINWEIS: An der Oberfläche der Scheibe befindet sich im Vergleich zum Inneren der Scheibe eine erhöhte Dichte an Fortsätzen und möglicherweise von Mikroglia, oft mit einer ungewöhnlichen Morphologie. Diese Anhäufung wird mit der Zeit auffälliger (z.B., sichtbarer in der letzten als in der ersten Gehirnscheibe, die abgebildet wird). Daher sollten die z-Ebenen in den ersten ~30 μm nicht für die Analyse verwendet werden und können für die Erfassung sogar übersprungen werden.
   12. Starten Sie die Aufnahme für eine Gesamtdauer von 30 Minuten (oder länger, falls gewünscht) und tragen Sie nach einer Baseline von 5 Minuten die zu testende Verbindung lokal auf (ohne Unterbrechung der Bildgebung). Drücken Sie dazu langsam den Kolben der Spritze, die mit der Mikropipette verbunden ist, von der 5-ml- auf die 1-ml-Position (in ca. 5 s). Ein Widerstand beim Drücken des Stößels muss sofort zu spüren sein. Wenn nicht, könnte die Spitze gebrochen sein.
       HINWEIS: Für einen geschulten Experimentator sind die Injektionen mit dieser Methode reproduzierbar, aber alternativ zur manuellen Manipulation einer Spritze könnte die Pipette mit einem automatisierten Druckabwurfsystem verbunden werden, um eine bessere Kontrolle des abgegebenen Volumens zu ermöglichen. Die Injektion erzeugt eine physikalische Verformung der Scheibe an der Stelle der Injektion. Diese Verzerrung ist in den ersten zwei oder drei Bildern nach der Injektion a posteriori sichtbar, sollte aber auf dem vierten Bild (d. h. 8 min nach der Injektion) nicht sichtbar sein. Wenn es weiterhin besteht, sollten Sie die Parameter für die Pipettenvorbereitung ändern.
   13. Am Ende der Erfassung (30 Minuten) entsorgen Sie die Mikropipette und entfernen Sie die Schnittscheibe.
   14. Bevor Sie mit der Abbildung einer neuen Schicht beginnen, machen Sie den 2D-Film (Abschnitt 2.1), um zu überprüfen, ob die Mikroglia eine normale Morphologie haben und sich bewegen und somit die Schichten gesund sind.

2. Analyse der Anziehungskraft von Mikrogliaprozessen

1. 2D-Projektion und Drift-Korrektur
   1. Öffnen Sie die Datei (. LIF) mit Fidschi.
   2. Falls nötig, erstellen Sie einen Substack (Image/Stacks/Tools/Make Substack) nur mit den Z-Ebenen, die Sie interessieren. Schließen Sie z. B. die Z-Ebenen aus, die der Oberfläche der Schicht entsprechen, wenn sie erfasst wurden, aber nicht für die Analyse verwendet werden sollen (siehe Anmerkung nach Schritt 1.2.11) und die tiefsten Z-Ebenen ohne Fluoreszenz. Der finale Stack enthält in der Regel 90 - 110 Z-Scheiben (180 - 220 μm).
   3. Starten Sie die Z project Funktion (Image/Stacks/Z Project<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>") und wählen Sie die Max Intensity<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Projektionstyp, um die Projektionen des Z-Stapels zu jedem Zeitpunkt zu erfassen Punkt.
   4. Starten Sie das MultiStackReg Plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>), auswählen Aktion 1: Align undTransformation: Rigid Body zur Korrektur geringfügiger Abweichungen, die während der Erfassung aufgetreten sein könnten. Speichern Sie diesen 2D-Film als neue Datei (.tiff).
2. Datenverarbeitung
   1. Öffnen Sie diese neue Datei mit Icy.
   2. Zeichnen Sie einen kreisförmigen R1 Region of Interest (ROI) mit einem Durchmesser von 35 μm, zentriert auf der Injektionsstelle (erkennbar insbesondere am Schatten der Pipette und der zum Zeitpunkt der Injektion entstehenden Verzerrung).
   3. Verwenden Sie das Plugin ROI intensity evolution und messen Sie die mittlere Intensität über Zeit in R1.
   4. Speichern Sie die Ergebnisse in einer .XLS Datei.
3. Quantifizierung und Darstellung der Ergebnisse
   1. Um die Reaktion der Mikroglia im Laufe der Zeit zu quantifizieren, bestimmen Sie zu jedem Zeitpunkt.
      Dann können die Ergebnisse als kinetische Reaktion der Mikroglia oder zu einem bestimmten Zeitpunkt dargestellt werden (siehe Figure 3).

Abbildung 1: Details zur Schnittstellenkammer. (A) Umriss für den 3D-Druck des Scheibenhalters. Der Außendurchmesser des Halters beträgt 7 cm. (B) Schnittstellenhalter mit dem Nylonnetz (Pfeil), das es den Forschern ermöglicht, die Scheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche zu halten. (C) Schnittstellenkammergerät, das es ermöglicht, die Scheiben in einer karbogenierten (der Pfeil zeigt den Schlauch für Blasenbildung anzeigen) und befeuchteten Umgebung zu halten, bevor sie abgebildet werden.

Abbildung 2: Details der Perfusionskammer. (A) Umriss für den 3D-Druck. Der Außendurchmesser der Perfusionskammer beträgt 5,9 cm. (B) Die Perfusionskammer mit dem Nylonnetz (Pfeil), das die Scheibe stützt, verhindert, dass sie den Objektträger darunter berührt, und lässt den Liquor über und unter ihr fließen. (C) Bild des Aufbaus am Zwei-Photonen-Mikroskop. Die Mikropipette, mit der die Verbindung lokal abgegeben wird, ist auf der rechten Seite zu sehen (Sternchen). (D) Pipette im Hellfeld aufgenommen. Der Maßstabsbalken = 60 μm.

Abbildung 3: Position der Mikropipette in der Scheibe. Beispiel für die Aufnahme eines Bildstapels (im Hippocampus eines 30 Tage alten Tieres) mit einer mit Fluorescein (1 μM) gefüllten Mikropipette. Fluorescein ermöglicht es, die Pipette (Sternchen) in den max. Projektionen entlang der z-Achse (A) der z-Achse oder (B) der y-Achse zu lokalisieren. Beachten Sie in der Tafel B, dass sich unter der Pipettenspitze auch Mikroglia befinden, obwohl sie in der Fluoreszenz schwächer sind. In diesem illustrierten Beispiel wurde der gesamte Stapel, einschließlich der Bilder, die im oberflächlichsten Teil des Slices aufgenommen wurden, für die Projektionen verwendet. Maßstabsleiste = 30 μm in Feld A und wie angegeben (jede Teilung = 50 μm) in Feld B. Die z-Dicke des Stacks = 220 μm.

Abbildung 4: Beispiele für suboptimale Experimente. Diese Schichten haben mehr als 6 Stunden gewartet, bevor sie abgebildet wurden, und wurden seit ihrer oberen Oberfläche abgebildet. (A) Beispiel für einen Z-Stapel mit viel Schmutz (grob runde, fluoreszierende Partikel, aber mit unregelmäßigen Rändern; Sternchen) und "buschigen" Mikroglia (Pfeile), d.h. mit zahlreichen, aber kurzen Fortsätzen. Beachten Sie die vergrößerten Fortsatzterminals (Pfeilspitzen), die wie axonale Wachstumskegel aussehen. Die z-Dicke des Stacks = 220 μm. Die anderen beiden Tafeln zeigen zwei Unterstapel desselben Slices, mit (B) 1-30 Z-Ebenen (z-Dicke = 59 μm) und (C) 30-120 Z-Ebenen (z-Dicke = 180 μm). Auf den oberen Ebenen (gezeigt in Tafel B) gibt es neben den großen Prozessanschlüssen und Ablagerungen wie in Tafel A Mikroglia mit ungewöhnlich großen flachen Körpern oder Vorsprüngen (Sternen). In den tieferen Ebenen (siehe Tafel C) gibt es weder Trümmer noch flache Objekte, aber die Zellen sind buschig (Pfeile) und die Dichte ist ungewöhnlich hoch. Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass sich die Mikroglia nicht in einem normalen Zustand befinden.