Mikroskopische Bildgebung von Neuronen in einem Mausgehirnschnitt mittels Golgi-Cox-Metallic-Färbung

Zusammenfassung

Quelle: Louth, E. L., et al. Bildgebung von Neuronen in dicken Hirnschnitten mit der Golgi-Cox-Methode. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Bildgebung von Neuronen in einem Golgi-Cox-gefärbten dicken Gehirnschnitt, indem obere und untere Fokusgrenzen festgelegt und überlappende Bilder aufgenommen werden. Mehrere Orte werden abgebildet, um detaillierte neuronale Projektionen zu gewährleisten, die zu einer 3D-Darstellung kombiniert werden.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Imprägnierung des Gehirns
   1. Die Golgi-Cox-Lösung aus 1% (w/v) Kaliumdichromat, 0,8% (w/v) Kaliumchromat und 1% (w/v) Quecksilberchlorid durch Auflösen des Kaliumdichromats herstellen und Kaliumchromat separat in hochwertigem Wasser zu verarbeiten. Mischen Sie die Lösungen, fügen Sie das Quecksilberchlorid hinzu und filtern Sie die endgültige Lösung mit Filterpapier der Güteklasse 1. Lagern Sie die Lösung bis zu einem Monat im Dunkeln.
   2. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran.
   3. Euthanasiere die Maus durch Enthauptung und entferne schnell das Gehirn.
   4. Legen Sie das Gehirn in ein 20 ml Glasszintillationsfläschchen mit 17 ml Golgi-Cox-Lösung und inkubieren Sie es im Dunkeln bei RT für 25 Tage.
   5. Kryoschützen Sie das Gehirn, indem Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose-Kryoprotektor (30% (w/v) Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) im Dunkeln bei 4 °C für 24 Stunden legen.
      HINWEIS: Die folgenden optionalen drei Schritte können als Alternative zum Hauptprotokoll verwendet werden, um das Gehirn in diesem Stadium für die Langzeitspeicherung einzufrieren.
   6. Frieren Sie das gesamte Gehirn ein, indem Sie es in 200 mL Isopentan tauchen, das auf Trockeneis vorgekühlt ist.
   7. Legen Sie das gefrorene Gehirn in ein konisches 50-ml-Röhrchen und lagern Sie es im Dunkeln bei -80 °C.
   8. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, tauen Sie das Gehirn auf, indem Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose-Kryoprotektivum legen und es 24 h lang bei 4 °C im Dunkeln halten.
2. Brain Sectioning
   1. Entfernen Sie das Gehirn aus der Saccharose und blockieren Sie es für die Sektion, indem Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge abschneiden und am verbleibenden kaudalen Ende des Gehirns eine flache Kante hinterlassen.
   2. Erhitzen Sie Agar (3% (w/v) in Wasser), bis es geschmolzen ist, und lassen Sie es dann abkühlen, bis es leicht über seinem Schmelzpunkt ist.
   3. Lege das Gehirn mit dem kaudalen Ende nach unten in eine kleine Einweg-Wiegeschale und füge eine ausreichende Menge geschmolzenen Agars hinzu, um es zu bedecken.
   4. Sobald der Agar erstarrt ist, schneiden Sie überschüssigen Agar ab, lassen Sie etwa 2 - 4 mm um das Gehirn herum und kleben Sie das Gehirn mit seinem kaudalen Ende nach unten mit einer kleinen Menge Ethylcyanacrylatkleber auf das Stadium eines Vibratoms.
   5. Füllen Sie den Bühnenbereich des Vibratoms mit einer ausreichenden Menge an Saccharose-Kryoprotektivum, um das Gehirn zu bedecken, und schneiden Sie das Gehirn bei einer Schichtdicke von 400 - 500 μm (abhängig von der zu untersuchenden Gehirnregion) mit einer Vibrationsfrequenz von 86 Hz und einer Klingenvorschubgeschwindigkeit von 0,125 mm/s.
   6. Lege mit einem kleinen Pinsel Gehirnschnitte in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte, die kommerziell erhältliche Netzbodeneinsätze enthält und mit 10 ml 6% (w/v) Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, vorgefüllt ist.
   7. Inkubieren Sie Abschnitte im Dunkeln bei 4 °C O/N.
3. Entwicklung von Gehirnabschnitten
   1. Übertragen Sie Gehirnschnitte in eine neue Vertiefung, die 5 ml 2% (w/v) Paraformaldehyd (PBD) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, enthält, indem Sie die Netzbodeneinsätze verwenden. Inkubieren Sie auf einer Wippe und bewegen Sie sich 15 Minuten lang langsam im Dunkeln bei RT.
   2. Abschnitte sollten zweimal gewaschen werden, indem sie in neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser umgefüllt werden. Sie sollten auf einer Wippe gewaschen werden, die sich mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
   3. Übertragen Sie Abschnitte in eine neue Vertiefung, die 5 mL 2,7% (v/v) Ammoniumhydroxid enthält. Inkubieren Sie auf einer Wippe und bewegen Sie sich 15 Minuten lang langsam im Dunkeln bei RT.
   4. Abschnitte sollten zweimal gewaschen werden, indem sie in neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser umgefüllt werden. Sie sollten auf einer Wippe gewaschen werden, die sich mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
   5. Übertragen Sie die Abschnitte in eine neue Vertiefung, die 5 mL Fixativ A enthält, das 10x von seiner ursprünglich gekauften Konzentration in Wasser verdünnt ist. Inkubieren Sie auf einer Wippe und bewegen Sie sich langsam im Dunkeln bei RT für 25 Minuten.
   6. Abschnitte sollten zweimal gewaschen werden, indem sie in neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser umgefüllt werden. Sie sollten auf einer Wippe gewaschen werden, die sich mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt.
4. Montieren von Gehirnabschnitten
   1. Montieren Sie mit einem kleinen Pinsel Schnitte auf Objektträger. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einem kleinen Taschentuch überschüssiges Wasser und Agar. Stellen Sie sicher, dass alle Agars entfernt werden, bevor Sie mit der Dehydrierung fortfahren.
   2. Lassen Sie die Schnitte ca. 45 min (400 μm Schnitte) bzw. 90 min (500 μm Schnitte) bei RT an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Das Timing und der richtige Trocknungsgrad sind entscheidend und müssen möglicherweise in jedem Labor abhängig von der Umgebungstemperatur und der Luftfeuchtigkeit bestimmt werden. Eine zu kurze Trocknungszeit führt dazu, dass bei den nachfolgenden Entwässerungsschritten Abschnitte von den Rutschen abfallen, und eine zu lange Trocknungszeit führt zu Rissen der Abschnitte. Die Abschnitte erscheinen auch bei entsprechender Trockenheit glänzend
   .
   3. Färben Sie Abschnitte mit Kresylviolett, indem Sie die Objektträger wie angegeben in Coplin-Färbegläser legen.
      HINWEIS: Dieser optionale Schritt kann für Schnitte verwendet werden, die noch nie eingefroren wurden, um neuronale Kerne mit Kresylviolett zu färben. Wir haben festgestellt, dass das Reinigen und Rehydrieren von Schnitten vor der Inkubation in Kresylviolett zu einer gleichmäßigen Färbung und einem niedrigen Hintergrund in allen Schnitten führt.
      1. Für 5 Minuten in das Clearing-Agent legen. Einmal wiederholen.
      2. 100% Ethanol für 5 Minuten einfüllen. Einmal wiederholen.
      3. Legen Sie 95% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 50% Ethanol in Wasser für jeweils 2 Minuten.
      4. Für 5 Minuten in Wasser legen.
      5. Lege 0,5% (w/v) cresylviolett für 7 min in Wasser.
      6. Für 2 Minuten in Wasser legen. Einmal wiederholen.
   4. Dehydrieren Sie Abschnitte, indem Sie Objektträger wie angegeben in Coplin-Färbegläser legen.
      1. 50% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 95% Ethanol in Wasser für jeweils 2 Minuten geben.
      2. 100% Ethanol für 5 Minuten einfüllen. Einmal wiederholen.
      3. Für 5 Minuten in das Clearingmittel legen. Einmal wiederholen.
         HINWEIS: Diese Dehydratisierungs- und Clearingzeiten reichen aus, um Mäusegehirne wie in diesem Manuskript beschrieben zu verarbeiten. Wir haben jedoch beobachtet, dass bei anderen Arten, einschließlich Ratten und Kuhvögeln, der letzte Rodungsschritt auf insgesamt bis zu 15 Minuten verlängert werden muss.
   5. Deckglasabschnitte mit einem wasserfreien Eindeckmedium.
   6. Lassen Sie die Dias mindestens 5 Tage lang horizontal im Dunkeln bei RT trocknen.

2. Bildgebung von gefärbten Neuronen in dicken Gehirnabschnitten

1. Erfassen von Bildstapeln
   1. Schalten Sie die Mikroskop-Glühbirne, die Kamera und den Tischcontroller ein.
   2. Öffnen Sie die Mikroskop-Software (z.B. Neurolucida).
   3. Platzieren Sie einen Objektträger auf dem Mikroskoptisch.
   4. Nehmen Sie ein 2D-Weitwinkelbild des Gehirnabschnitts mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung auf, z. B. 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO oder 4X 0.16 N.A.
      1. Fokussieren Sie sich auf das Bild und passen Sie die Kameraeinstellungen an, einschließlich der Belichtungszeit und des Weißabgleichs.
      2. Erstellen Sie einen Referenzpunkt, indem Sie mit der linken Maustaste auf eine beliebige Stelle im Abschnitt
      3. klickenNehmen Sie das Bild auf, indem Sie im Bildaufnahmefenster "Einzelbild aufnehmen" auswählen.
   5. Erfassen Sie Bildstapel mit mittlerer Auflösung des Bereichs, der die interessierenden Neuronen enthält, mit einem 10X 0.3 N.A. UPlan FL N Objektiv.
      1. Fokussieren Sie sich auf das Bild und passen Sie die Kameraeinstellungen an, einschließlich der Belichtung und des Weißabgleichs.
      2. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen für den Bildstapel fest, indem Sie auf den oberen Rand des Abschnitts fokussieren und "festlegen" neben "oben im Stapel" innerhalb des Bildaufnahmefensters auswählen, und dann auf den unteren Rand des Abschnitts fokussieren und "setzen" neben "unterer Teil des Stapels" innerhalb des Bildaufnahmefensters auswählen.
      3. Setze den Schrittabstand auf 5 μm, indem du "5 μm" neben "Abstand zwischen Bildern" im Bildaufnahmefenster eingibst.
      4. Erfassen Sie den Bildstapel, indem Sie im Bildaufnahmefenster "Bildstapel erfassen" auswählen.
      5. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um den gesamten Interessenbereich zu erfassen, und stellen Sie sicher, dass sich alle Bildstapel in der X- und Y-Achse um mindestens 10% überlappen.
   6. Erfassen Sie hochauflösende Bildstapel des Bereichs, der das interessierende Neuron enthält, mit einem 30X 1.05 N.A. Silikon-Öl-Immersionsobjektiv.
      1. Tragen Sie 3 - 4 Tropfen Silikon-Immersionsöl auf den Objektträger auf und platzieren Sie das Objektiv über dem Objektträger, wobei Sie den Kontakt zwischen dem Objektiv und dem Öl sicherstellen.
      2. Fokussieren Sie sich auf das Bild und passen Sie die Kameraeinstellungen an, einschließlich der Belichtung und des Weißabgleichs.
      3. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen für den Bildstapel fest, indem Sie auf den oberen Rand des Abschnitts fokussieren und "festlegen" neben "oben im Stapel" innerhalb des Bildaufnahmefensters auswählen, und dann auf den unteren Rand des Abschnitts fokussieren und "setzen" neben "unterer Teil des Stapels" innerhalb des Bildaufnahmefensters auswählen.
      4. Setze den Schrittabstand auf 1 μm, indem du "1 μm" neben "Abstand zwischen Bildern" im Bildaufnahmefenster eingibst.
      5. Erfassen Sie den Bildstapel, indem Sie im Bildaufnahmefenster "Bildstapel erfassen" auswählen.
      6. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um den gesamten Interessenbereich zu erfassen, und stellen Sie sicher, dass sich alle Bildstapel in der X- und Y-Achse um mindestens 10% überlappen.
   7. Speichern Sie die Datendatei und alle Bilddateien im TIFF-Format für die externe Verarbeitung.
2. Erstellen von Z-Projektionsbildern und Bildmontagen
   1. Erstellen von Z-Projektionsbildern in ImageJ
      1. Öffnen Sie die ImageJ-Software, auf der das Bio-Formats-Plugin installiert ist.
      2. Select "Plugins" -> "Bio-Formate" -> "Bio-Formats Importer".
      3. Wählen Sie die zu öffnende Bildstapeldatei aus.
      4. Sobald die Datei geöffnet ist, ändern Sie das Format in RGB, indem Sie "Bild" -> "Typ" -> "RGB-Farbe" auswählen.
      5. Erstellen Sie die Z-Projektion, indem Sie "Bild" -> "Stapel" -> "Z-Projekt..." auswählen.
      6. Speichern Sie das zweidimensionale Z-Projektionsbild als TIFF-Datei.
   2. Erstellen Sie eine zweidimensionale Bildmontage des gesamten Interessenbereichs.
      <
      1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Öffnen Sie die Software (z.B. Adobe Photoshop).
      2. Select "Datei" -> "Automatisieren" -> "Photomerge".
      3. Wählen Sie "Durchsuchen" und fügen Sie dann alle Bilddateien hinzu, die zusammengeführt werden sollen.
      4. Stellen Sie sicher, dass "Bilder mischen" ausgewählt ist und wählen Sie dann "OK".
      5. Speichern Sie das resultierende Montagebild des gesamten Interessenbereichs als TIFF-Datei.

Materialien