Bildgebung der neuronalen Aktivierung im Hippocampus in Gehirnschnitten von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Provenzano, G., et al. Immunhistochemische Visualisierung der Neuronenaktivität im Hippocampus nach räumlichem Lernen in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video demonstriert die immunhistochemische Bildgebung zur Visualisierung der neuronalen Aktivierung des Hippocampus. Gefärbte Hirnschnitte zeigen unter einem Hellfeldmikroskop dunklere Regionen, was auf aktivierte Neuronen hinweist.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Immunhistochemie

1. Übertragen Sie 3-5 dorsale Hippocampusschnitte für jede Maus in 24 Multi-Well-Platten mit 500 μl 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jede Vertiefung.
2. Waschen Sie die in jeder Vertiefung enthaltenen Abschnitte mit 500 μl 0,1 M PBS (5 min, 3 Mal unter leichtem Schütteln).
3. Quenken Sie die endogene Peroxidase-Aktivität, indem Sie Schnitte in 1 % Wasserstoffperoxid (H₂O₂) in PBS für 20 min unter leichtem Rühren inkubieren.
4. Waschen Sie die Abschnitte in 0,1 M PBS unter sanftem Rühren (3 x 5 min).
5. Permeabilisierung des Gewebes: Inkubieren Sie Schnitte für 5 Minuten in 0,2% Triton X-100 in PBS.
6. Während der obigen Schritte (1.4; 1.5) stellen Sie genügend Blockierungspuffer (10 % Ziegenserum und 0,1 % Triton-X100 in PBS) für das gesamte Experiment her (Anzahl der Schnitte x 100 μl x 3 Schritte).
7. HINWEIS: Verwenden Sie Serum von derselben Spezies, in der der Sekundärantikörper (Ab) (konjugiert mit Biotin) hergestellt wurde.
8. Verhindern Sie eine unspezifische Bindung des Antikörpers, indem Sie die Abschnitte in einem Blockierungspuffer (100 μl/Abschnitt) für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Rühren inkubieren.
9. Inkubieren Sie Schnitte in primärer Ab-phosphorylierter extrazellulärer signalregulierter Kinase (pERK), verdünnt in Blockpuffer über Nacht bei 4 °C, unter sanftem Rühren.
10. Waschen Sie die Abschnitte in 0,1 M PBS unter sanftem Rühren (3 x 5 min).
11. Mit dem sekundären Ab, konjugiert mit Biotin (1:250), verdünnt in Blockierungspuffer (wie in Schritt 1.6 verwendet), 1 Stunde lang bei RT unter leichtem Rühren inkubieren.
12. Bereiten Sie gleichzeitig das Reagenz des Avidin-Biotin-Komplexes (ABC) vor, da Avidin und Biotin mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur benötigen, um zu komplexieren.
13. Bereiten Sie das erforderliche Volumen des ABC-Reagenzes gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
14. Waschen Sie die Abschnitte in 0,1 M PBS unter sanftem Rühren (3 x 5 min).
15. Inkubieren Sie die Schnitte 45 Minuten lang bei RT mit ABC-Reagenz.
16. Waschen Sie die Abschnitte in 0,1 M PBS unter sanftem Rühren (3 x 5 min).
17. Zur Herstellung einer Arbeitslösung für Diaminobenzidin (DAB) muss jeder Schritt, an dem DAB beteiligt ist, im Abzug durchgeführt werden, da DAB krebserregend und teratogen ist.
18. Übertragen Sie die DAB-Lösung mit einer Kunststoff-Transferpipette auf eine neue Platte.
19. Legen Sie die Abschnitte in die Platte, die die DAB-Arbeitslösung enthält, und schwenken Sie die Platte langsam von Hand, um eine maximale Exposition der Schnitte zu ermöglichen.
20. Überwachen Sie die DAB-Reaktion am Mikroskop, bis sich ein ausreichendes Signal entwickelt (2-5 Minuten).
21. Stoppen Sie die Reaktion bei der gewünschten Farbintensität, indem Sie das Tuch in 0,1 M PBS (3 x 5 min) waschen.
22. Verwenden Sie Bleichmittel, um die verbleibende DAB-Substratlösung im Abzug über Nacht zu deaktivieren, und entsorgen Sie sie gemäß den Laborrichtlinien.
23. Montieren Sie Abschnitte auf gelatinebeschichtete Objektträger, indem Sie sie in PBS schweben lassen. Trocknen Sie sie dann mindestens 3-4 Stunden bei Raumtemperatur.
24. Die Abschnitte nacheinander in 50 %, 70 %, 95 % und 100 % Ethanol für jeweils 2 min dehydrieren und 5 min in 100 % Xylol reinigen.
25. Deckglas mit Eindeckmedium und über Nacht in einem Abzug trocknen lassen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Wird verwendet, um einen Ethanolgradienten für die Dehydrierung vor der Montage der Folie zu erzeugen.
Xylole	VWR	66004-950<
PBS	Sigma	P3813-10PAK<
Triton X-100	Sigma	T-8787<
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normales Ziegenserum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100<
DAB Peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100<
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370<
Biotinylierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper	Vector Laboratories	BA-1000	Verdünnung 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879<
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Montagemedium für Dias. Es kann ein gleichwertiges Eindeckmedium verwendet werden.

td style='width:311pt;'>Giftig - für den Einsatz unter der Motorhaube. Wechseln Sie das Xylol je nach Verwendung jeden Monat.td style='width:311pt;'> td style='width:311pt;'> td style='width:311pt;' >Fügen Sie ein Volumen von 5 ml PBS 2 Tropfen Reagenz A hinzu, mischen Sie und fügen Sie dann 2 Tropfen Reagenz B hinzu und mischen Sie.td style='width:311pt;'>Fügen Sie ein Volumen von 5 ml doppelt destilliertem Wasser hinzu: 2 Tropfen Pufferlösung und mischen; 4 Tropfen DAB und mischen; 2 Tropfen Wasserstoffperoxid und mischen.td style='width:311pt;'>Verdünnung 1:500td style='width:311pt;'>