Dieses Video demonstriert die Verwendung von FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)-basierten Sensoren zur Messung des intrazellulären ATP-Spiegels in organotypischen Hippocampus-Schnitten der Maus, die eine Echtzeit-Visualisierung der ATP-Dynamik in Neuronen und Astrozyten unter physiologischen und experimentellen Bedingungen ermöglichen.
Methodenartikel
Abbildung der intrazellulären ATP-Dynamik mit FRET-basierten Sensoren in einem organotypischen Hippocampus-Schnitt der Maus
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28. April 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
1. FRET-based ATP Imaging (Abbildung 1)
- Bereiten Sie vor dem Experiment E-ACSF vor und blasen Sie es mindestens 30 Minuten lang mit 95 % O2/5 % CO2, um einen pH-Wert von 7,4 zu erhalten. Schalten Sie die Leuchtstoffröhre (Xenonlampe) des Monochromators ein (Abbildung 1). Starten Sie die Perfusion, kurz bevor Sie die Scheibe aus dem Inkubator nehmen.
HINWEIS: Halten Sie die Kochsalzlösung während des gesamten Experiments mit 95% O2 und 5% CO2 gefüllt. - Übertragen Sie die Scheibe in eine Versuchskammer, die mit einer Peristaltikpumpe ständig mit frisch carbogenisiertem E-ACSF durchblutet wird (Abbildung 1). Fixieren Sie dann das Slice mit einem Raster. Stellen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch und schließen Sie das Perfusionssystem an. Für die Perfusion wird ein gasdichter Laborschlauch empfohlen.
HINWEIS: Experimente können je nach Versuchsplan bei Raumtemperatur oder nahe physiologischer Temperatur durchgeführt werden. Überprüfen Sie die Stabilität und Zuverlässigkeit des Perfusionsflusses, um Fokusänderungen zu vermeiden, die durch Bewegungen des Gewebes und/oder Änderungen der Scherspannung induziert werden. Die Standardperfusionsgeschwindigkeiten für Slice-Arbeiten, die von uns und vielen anderen Laboren verwendet werden, betragen 1,5-2,5 mL/min. - Bringen Sie die kultivierte Scheibe mit einem Transmissionslicht in den Fokus. Identifizieren Sie den Bereich, in dem Experimente durchgeführt werden sollen (z. B. die CA1-Region des Hippocampus). Warten Sie vor Beginn der bildgebenden Experimente mindestens 15 Minuten, damit sich die Schichten an die Salzbedingungen anpassen können. Zur Konfiguration des Versuchsaufbaus siehe Abbildung 1.
- Schalten Sie die Kamera und die Bildgebungssoftware ein. Wählen Sie dann den richtigen Filterwürfel aus.
- Stimulieren Sie das fluoreszierende Donorprotein (eCFP) bei 435/17 nm (~435 nm). Stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 40 und 90 ms ein.
HINWEIS: Eine starke Exposition von Schichten gegenüber dem fluoreszierenden Licht kann zu phototoxischen Effekten führen. - Anregung bei 435 nm führt zu Emission sowohl bei 475 nm (eCFP; Donor) als auch bei 527 nm (Venus; Akzeptor). Teilen Sie die Fluoreszenzemission bei 500 nm mit einem Emissionsbildsplitter auf und verwenden Sie Bandpassfilter bei 483/32 und 542/27, um die Donor- und Akzeptorfluoreszenz weiter zu isolieren. Eine starke Expression kann zu einer Sättigung der Detektoren führen. In diesem Fall können Sie einen Neutraldichtefilter verwenden, um die Intensität der Anregung zu reduzieren.
- Wählen Sie einen Bereich von Interesse (ROI) aus, der anscheinend keine zelluläre Fluoreszenz für die Hintergrundsubtraktion aufweist. Erstellen Sie dann ROIs, die Zellkörper abgrenzen.
- Legen Sie die Häufigkeit der Bildaufnahme und die Gesamtaufnahmezeit fest. Für lange Experimente (>30 min) wird eine Erfassungsfrequenz von 0,2-0,5 Hz empfohlen, um Phototoxizität zu verhindern.
- Starten Sie die Aufnahme. Es wird empfohlen, mindestens 5 Minuten unter Ausgangsbedingungen aufzuzeichnen, um die Stabilität des Präparats zu gewährleisten.
HINWEIS: Passen Sie den Fokus der Zelle während der Aufnahme bei Bedarf an.
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Ergebnisse
Abbildung 1: Konfiguration des FRET-Imaging-Setups. (A) Schematische Darstellung der verschiedenen Komponenten und ihrer räumlichen Anordnung, die für den FRET-Bildgebungsaufbau e...
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338< | |
| Bandpassfilter 483/32< | Splitter kompatibler Emissionsfilter | ||
| Bandpassfilter 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter kompatibler Emmision Filter | |
| Strahlteiler T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
| Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
| Datenverarbeitung Origin Pro 9.0.0 (64- bit) | OriginLab corporation | Wissenschaftliche Grafik- und Datenanalysesoftware | |
| D-Glucose-Monohydrat | Caelo | 2580-1kg | |
| DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung |
| Eclipse E 600FN aufrechtes Mikroskop | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse FN1 aufrechtes Mikroskop | Nikon Microscope Solutions | ||
| Experimental | custom build | Perfusionskammer für Live-Cell Imaging | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | Mit Phenolrot für die pH-Überwachung |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278< | |
| Thermo Scientific/FEI | Ultra schnell Umschalten des Monochromators | ||
| Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
| NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging-Software. Aktualisierte Version für FRET imaging | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
| Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon Schlauch, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
| Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe< | Bildverarbeitungssoftware | |
| ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244< | |
| ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307< |
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