Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Wang, Z., et al. Transpupilläre Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine Technik für die in vivo Netzhautbildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Anästhesierte Mäuse werden auf die Bildgebung vorbereitet, indem sie ihren Kopf sichern, Augenschmiermittel auftragen und ein Deckglas über das Auge legen. Retinale Ganglienzellen (RGCs), die fluoreszierende Proteine exprimieren, werden zunächst mittels Epifluoreszenz zur Ausrichtung sichtbar gemacht. Schließlich wird die Zwei-Photonen-Bildgebung eingesetzt, die eine hochauflösende Visualisierung von RGCs ermöglicht.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und dem Veterinärprüfungsausschuss der JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Maus für die Bildaufnahme

1. Anästhesiemaus für die Bildgebung{{}}
   HINWEIS: Um die Exposition gegenüber Isofluran zu verringern, sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Abgasreinigung. Stellen Sie sicher, dass die Auslassöffnung der Anästhesie-Induktionskammer mit einem passiven Spülgasfilterbehälter verbunden ist und der Auslass des Maus-Anästhesie-Objektivrevolvers mit einem aktiven Spülgasfilterbehälter verbunden ist, wobei ein Vakuum von einem Gasevakuierungsgerät bereitgestellt wird. Befolgen Sie die Richtlinien des Herstellers zur Überwachung des Gewichts des Filterbehälters für den Austausch.
   1. Betäuben Sie die Maus mit dem Ketamin/Xylazin-Cocktail. Alternativ kann eine Anästhesie durch Isofluran-Inhalation eingeleitet werden, wenn Isofluran auch zur Aufrechterhaltung der Anästhesie verwendet wird (Bildgebungssitzung > 30 min). Stellen Sie das Kleintieranästhesiegerät so ein, dass es die Induktionskammer mit 5 % Isofluran gemischt mit Raumluft bei einer Durchflussmenge von 0,5 l/min füllt. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und warten Sie 15 s, bis die Maus betäubt ist.
   2. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 0% und leiten Sie den Anästhesiefluss zum Objektivrevolver. Führen Sie eine 5-sekündige "O₂ Spülung" der Induktionskammer durch. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und befestigen Sie sie in der Kopfhalterung, an der der Objektivrevolver befestigt ist.
   3. Verwenden Sie ein Gemisch aus 1 % Isofluran mit Raumluft bei einer Durchflussrate von 0,5 l/min zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Überwachen Sie die Atemfrequenz während der gesamten Anästhesie in 5-Minuten-Intervallen und passen Sie den Isoflurananteil an, um eine Atemfrequenz von ~60 Atemzügen/min aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Diese Einstellungen (% Isofluran, Flussrate) können auch zur Aufrechterhaltung der durch den Ketamin/Xylazin-Cocktail induzierten Anästhesie verwendet werden.
2. Pupillenerweiterung
   1. Bereiten Sie eine Lösung aus 1 % w/v Atropin und 2,5 % w/v Phenylephrinhydrochlorid in Wasser vor. Lagern Sie die Dilatatorlösung bei Raumtemperatur lichtgeschützt.
   2. Tragen Sie mit einer Einwegpipette einen Tropfen der Dilatatorlösung auf jedes Auge auf, das abgebildet werden soll. Schalten Sie das Raumlicht aus und warten Sie 5 Minuten, bis sich die Pupille erweitert hat. Wenn die Pupille erweitert ist, tupfen Sie die Dilatatorlösung mit fusselfreiem Gewebe ab.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dilatatorlösung nicht in die Nasenlöcher gelangt.
   3. Tragen Sie einen großen Tropfen Gleitgel auf jedes Auge auf, das abgebildet werden soll. Wenn beide Augen abgebildet werden sollen, tragen Sie ein kleines Stück Plastikfrischhaltefolie über das Augengel auf dem nicht abbildenden Auge auf, um eine Austrocknung zu verhindern. Wenn Sie nur ein Auge abbilden, tragen Sie Gleitmittel-Augensalbe auf das Auge auf, das nicht abgebildet wird.
3. Positionierung der Maus für die Bildgebung
   1. Um die Maus in der Halterung des Bildgebungskopfes zu befestigen, drehen Sie den Hauptarm der Kopfhalterung, bis die Hörmuschelstange in einem Winkel von 60° oder mehr unter der Horizontalen geneigt ist. Befestigen Sie den unteren Gehörgangsstift in der nach innen gestreckten Position und den oberen Gehörgangsstift in der zurückgezogenen Position.
   2. Montieren Sie mit der Maus in Richtung der Beißstange ein Ohr auf den verlängerten unteren Stift und führen Sie den Stift in den Gehörgang ein. Lösen Sie die Schraube, mit der der obere Gehörgangsstift befestigt ist, und verlängern Sie den Stift in den anderen Gehörgang. Ziehen Sie die Schraube fest, um den Kopf zu sichern.
   3. Schieben Sie die Beißleiste in Richtung des Kopfes der Maus. Heben Sie den Kopf der Maus vorsichtig an und senken Sie dann die Oberkieferschneidezähne der Maus in das Loch der Beißstange ab. Ziehen Sie die Beißstange mit sanfter Kraft zurück, um den Kopf der Maus zu sichern, und sichern Sie die Position der Beißstange, indem Sie die Schraube festziehen.
   4. Wenn Sie Isofluran verwenden, schieben Sie den Nasenbügel durch den Schlitz auf die Beißstange, bevor Sie die Schneidezähne der Maus sichern. Sichern und festziehen Sie die Position der Beißstange wie in Schritt 1.3.3 beschrieben. Ziehen Sie den Nasenbügel mit den beiden Schrauben an der Oberseite fest, bis er eng an der Nase der Maus anliegt, aber die Schnauze nicht einengt.
   5. Übertragen Sie die Maus in der Kopfhalterung auf den Mikroskoptisch unter dem Objektiv. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Pupille des Auges gerade nach oben ausgerichtet ist, in einer Linie mit dem Strahlengang (Abbildung 1).
   6. Legen Sie ein Deckglas #1,5 in den kompakten Filterhalter und befestigen Sie den Halter am Mikroskoptisch. Senken Sie das Deckglas in Richtung Auge ab und berühren Sie das Gleitaugengel, so dass es horizontal unmittelbar über der Hornhaut liegt (Abbildung 1). Achten Sie darauf, dass das Deckglas die Hornhaut nicht berührt.
      HINWEIS: Stellen Sie am Mikroskop sicher, dass der Anregungslichtweg auf Epifluoreszenz und der Emissionslichtweg auf das Okular eingestellt ist. Schalten Sie die Epifluoreszenzbeleuchtung auf niedrigster Stufe ein und öffnen Sie den Verschluss der Beleuchtung. Wählen Sie die Wellenlänge des Epifluoreszenzbeleuchtungsgebers und den Fluoreszenzfilter, die dem abzubildenden Fluorophor entsprechen.
   7. Manövrieren Sie den Tisch in den X-Y-Dimensionen und das Objektiv in der Z-Position mit der Tischsteuerung und dem motorisierten Fokusantrieb, bis das Weitfeld-Anregungslicht die Hornhaut vollständig bedeckt. Wenn Sie durch das Okular schauen, stellen Sie die Z-Position des Tisches so lange ein, bis die fluoreszierenden Zellen oder Strukturen in der Netzhaut in den Fokus kommen. Erhöhen Sie die Leistung des Epifluoreszenzbeleuchtungsgeräts, wenn das Probensignal nicht hell genug ist, um einzelne Zellen oder Strukturen von Interesse durch das Okular aufzulösen.
      HINWEIS: Wenn Sie Schwierigkeiten haben, die Netzhaut zu lokalisieren, ist die Iris ein kontrastreicher Orientierungspunkt, an dem Sie sich verankern und dann auf die Netzhaut fokussieren können. In diesem Schritt kann auch überprüft werden, ob die Pupille maximal erweitert ist.
   8. Erhalten Sie mit der Mauslinse einen Bildbereich auf der Achse. Passen Sie den Winkel der Maus mit den verschiedenen Freiheitsgraden an der Kopfhalterung an, bis beim Einstellen der Fokusebene nur noch eine Ausdehnung oder Kontraktion des unscharfen Lichts auftritt. Schalten Sie die Epifluoreszenzbeleuchtung aus und schließen Sie den Verschluss der Beleuchtung.
      HINWEIS: Eine signifikante X-Y-Parallaxe von unscharfem Licht beim Scrollen durch die Z-Richtungs-Fokusebenen weist darauf hin, dass sich die Netzhaut in Bezug auf den Bildstrahlengang nicht auf der Achse befindet.

2. Zwei-Photonen-Bildaufnahme

1. Bildeinrichtung und -aufnahmeparameter
   HINWEIS: Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus und decken Sie streunende Lichtquellen im Raum ab. Stellen Sie sicher, dass die Epifluoreszenzbeleuchtung ausgeschaltet und der Verschluss der Beleuchtung geschlossen ist.
   1. Schalten Sie den Anregungslichtweg auf den Laser und den Emissionslichtweg auf die Photomultiplier-Röhren (PMTs) um.
   2. Stellen Sie in der Bilderfassungssoftware eine Bildgröße von 512 x 512 und einen Bilddurchschnitt von 3 ein. Stellen Sie die Schritte pro Schicht auf -8 μm ein. Legen Sie die Z-Stufe so fest, dass sie am oberen Rand des Stapels beginnt und nach unten fortschreitet, wodurch die Zwei-Photonen-Laseraktivierung von Photorezeptoren minimiert wird.
      HINWEIS: Die Schrittgröße kann reduziert werden, um die Z-Auflösung zu erhöhen, was zu einer längeren Bildgebungszeit führt, aber 8-μm-Schritte sind ausreichend, um Zellsomata in dieser Bildgebungskonfiguration aufzulösen.
   3. Schalten Sie die PMTs ein und aktivieren Sie sie. Stellen Sie die PMT-Spannung auf 680 V ein. Aktivieren Sie den Erregershutter.
      HINWEIS: Angetriebene PMTs sind anfällig für leichte Schäden. Stellen Sie sicher, dass die Epifluoreszenzbeleuchtung ausgeschaltet ist, der Vorhang des Mikroskopgehäuses zugezogen und die Raumbeleuchtung ausgeschaltet ist.
   4. Starten Sie eine Live-Bildvorschau des Zielgewebes, beginnend mit 1 % Laserleistung. Passen Sie die Bildschirmhelligkeit automatisch an, um die Zellen oder Strukturen von Interesse zu visualisieren. Passen Sie die Scanphase automatisch an. Wenn das Zielgewebe dunkel oder unklar ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Laserleistung, bis Strukturen sichtbar werden, ohne den in Schritt 2.4.4 festgelegten Grenzwert von 45 mW zu überschreiten.
      HINWEIS: Für ein 16-Bit-Bild zeigt ein Anzeigewert von ~1000 bei der automatischen Anpassung der Helligkeit in einer Z-Ebene mit interessanten Strukturen eine ausreichende Helligkeit des Samples an.
   5. Manövrieren Sie den Mikroskoptisch in X-Y-Richtung, um ihn auf einen gewünschten Bildgebungsbereich zu zentrieren, und navigieren Sie dann zur Z-Ebene mit den interessierenden Strukturen im Fokus.
      HINWEIS: Die Bildgebung in der Nähe des Sehnervenkopfes ermöglicht es, als eindeutiger Orientierungspunkt für chronische Bildgebungsexperimente zu dienen.
   6. Wenn es sich um ein chronisches Zeitrafferexperiment handelt, öffnen Sie ein vorheriges Bild auf dem Aufnahmecomputer, und verwenden Sie es als Referenz, um denselben Interessenbereich zu finden. Stellen Sie sicher, dass der Bildgebungswinkel ähnlich ist wie bei früheren Bildern, um die gleiche Gruppe von Zellen mit minimaler Parallaxe zu erfassen.
      HINWEIS: Um die gleichen Zellen wie in früheren Zeitpunkten abzubilden (Abbildung 2), ist wahrscheinlich eine weitere Anpassung der Mauskopfposition erforderlich.
   7. Legen Sie die Z-Grenzwerte des Imaging-Stacks fest, indem Sie zur obersten und untersten Z-Ebene von Interesse navigieren, und erfassen Sie das Bild. Deaktivieren Sie nach Abschluss der Bildaufnahme die PMTs und den Emissionsverschluss. Schalten Sie den Emissionslichtweg zurück zum Okular und den Anregungslichtweg auf Epifluoreszenzbeleuchtung. Nehmen Sie die Maus vom Mikroskoptisch.

Ergebnisse

Abbildung 1: Positionierung von Mäusen für die in vivo Bildgebung. Um die Maus mit der Pupille auf der Achse mit dem Strahlengang zu positionieren, wird die betäubte Maus zunächst in einer Kopfhalterung fixiert, der Kopf gedreht und abgewinkelt, ein großer Tropfen Gleitgel für die Augen wird auf das Auge aufgetragen und die Maus wird auf den Tisch g...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#1.5 Deckglas	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL Glasspritze	Hamilton	80950	22G zementierte Nadel
Anästhesie-Luftpumpe	RWD Life Science	R510-30
Atropin	Sigma	A0132	Für Pupillendilatatorlösung
Basic Anästhesiegerät für Kleintiere	RWD Life Science	R500IE
Borosilikatglas Kapillare	Sutter	B150-86-10	Außendurchmesser 1,50 mm, Innendurchmesser 0,86 mm, Länge 10 cm
CFP/YFP Filterwürfel	Chroma	custom	480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Zweikanal PMT-Detektionseinheit	Scientifica	S-MPLG-1002
Umwälz-Wärmepumpe	Braintree Scientific	tp-700	Auf 37 °C eingestellt
Frischhaltefolie	VWR	10713-916
Kompakter Filterhalter	ThorLabs	DH1	Hält Deckglas über Mausauge
Cx3cr1-GFP transgene Mäuse (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	The Jackson Laboratory	5582
DAQ-Controller-Chassis	National Instruments	PXIe-1073
Datenerfassungsgerät	National Instruments	BNC-2090A
FPGA-Modul mit Digitizer	National Instruments	NI-5734
Gasevakuierungsgerät	RWD Life Science	R546W
GenTeal Severe Gleitmittel Augengel	Alcon	(aus der örtlichen Apotheke)	Zur Verwendung während der Bildgebung
GFP/Red Filter cube Chroma		custom	535/30, 560 long pass, 605/70<
McKesson Medical and Surgical 190147
HyperScope Launch Optics zur Verwendung mit Pockels Cell	Scientifica	S-MP-101080
HyperScope Hauptmodul	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X Galvo Module	Scientifica	MP-100443
ImageJ Fiji software		Freeware
Isofluran	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Isofluran-Gasfilterbehälter (aktive Spülung)	RWD Life Science	R510-31
Isofluran-Gasfilterbehälter (passive Spülung)	RWD Life Science	R510-31S
Ketamin HCl (100 mg/ml)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 auf M26 Adapter	ThorLabs	M32M26S
MaiTai GUI Software	Spectra-Physics	NA
MATLAB software	MathWorks	NA	R2015b<
Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	Analgetikum
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
Mikropipettenabzieher	Sutter	Flaming/Braun Modell P-97
Mineralöl	Fisher	BP2629-1
Mini Bulldog hämostatische Klemme	Fine Science Tools	18053-28
Miniatur EVA Schlauch 0.02" ID, 0.06" OD	McMaster Carr	1883T1
Miniatur EVA Schlauch 0.05" ID, 0.09" OD	McMaster Carr	1883T4
Mauskopf Halter	Narishige	SGM-4
Nr. 5 Pinzetten	Fine Science Tools	11251-10
Optic Posts 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
Optisches Leistungsmesser-Kit	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
Phenylephrinhydrochlorid	Sigma	P6126	Für Pupillendilatatorlösung
Pockels-Zelle		Conoptics 350-80-02
Pockels-Zellverstärker	Conoptics	Model 302RM
Proparacainhydrochlorid	Sigma	1571001	Für die Ruhigstellung
Rot & Far Red Kurzpassfilter Cube	Chroma	custom	560 short pass
Drehbare 1/2" Pfostenklemme	ThorLabs	SWC
ScanImage Paket	Vidrio Technologies	Freeware	Bilderfassungssoftware; Version 5.4.0 (2018); benötigt MATLAB
Natriumchloridlösung, steril (0.9%)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomikroskop	Leica	S9 E
Tischzentrifuge	Oxford	Benchmate C8
Terramycin oxytetracyclin/polymyxin B antibiotikum Augensalbe	Zoetisus	NA	Zur Verwendung nach intravitrealer Injektion
ThermoRack-Kühlsystem	Festkörperkühlsysteme	ThermoRack 401	Auf 20 °C
Ultraschneller Ti:Saphir-Laser	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre transgene Mäuse (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16962
VGlut2-Cre transgene Mäuse (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16963
VivoScope for In Vivo Imaging	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
Weiße Vaseline-Mineralöl Gleitmittel Augensalbe	Stye	NA	Für Nach der Bildgebung
Xylazin HCl (20 mg/ml)	Akorn	NDC 59399-110-20

td style='height:15.75pt;'>Heizkissentd style='height:15.75pt;'>Meloxicam (5 mg/ml) der Augen eingestellt verwenden