Fluoreszenzbildgebung der neuroimmunen Dynamik mit Hilfe eines Schädelimplantats

Zusammenfassung

Quelle: Bisht, K., et al. Präzises Mapping des Gehirns zur Durchführung einer repetitiven In-vivo-Bildgebung der Neuroimmundynamik bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung der Neuroimmundynamik in einer transgenen Maus mit einem Schädelimplantat. Die vaskuläre und neuronale Stabilität wird neben dynamischen Veränderungen der Mikroglia abgebildet, die die Immunreaktionen auf neuronale Aktivität widerspiegeln.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.

1. Vorbereitung der Maus für die Implantation

von SchädelfensternHINWEIS: Verschiedene transgene Mauslinien mit fluoreszierenden Tags eignen sich für die Bildgebung.

1. Verwende CX3CR1GFP/+ Mäuse, um Mikroglia in vivo zu visualisieren. In der Regel werden juvenile bis junge erwachsene Mäuse im Alter von 4 bis 10 Wochen mit einem Gewicht von 17-25 g verwendet.
   HINWEIS: Obwohl dieser Ansatz sogar für vorentwöhnte Mäuse geeignet ist, kann die Notwendigkeit, die Mäuse zur Fütterung mit ihren Müttern in ihre Käfige zurückzubringen, die Genesung erschweren, wenn die Mutter sich nach der Operation nicht angemessen um die Welpen kümmert. Daher wird der Einsatz von Mäusen nach dem Absetzen empfohlen.
2. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (5% Sauerstofffluss zur Induktion für 1 min) in einer Anästhesiekammer. Vergewissern Sie sich, dass die Maus keine Bewegungen oder Zuckungen auf Zehen- und/oder Schwanzzwicken zeigt. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und rasieren Sie die Haare am Kopf zwischen den Ohren von etwa Augenhöhe bis zum oberen Halsbereich mit einem Haarschneider gründlich an der frischen Luft.
   HINWEIS: Die verwendete Isoflurankonzentration hängt von der Größe der Induktionskammer ab. Daher kann bei kleineren Kammern 3-4% Isofluran verwendet werden, um eine Anästhesie effektiv zu induzieren, während bei größeren Kammern bis zu 5% erforderlich sind.
3. Bewegen Sie die Maus zur Anästhesie zur Nasenkonus der stereotaktischen Operationsstation (1,5-2% für die Wartung während der Operation), stabilisieren Sie ihren Kopf mit Ohrstangen und halten Sie die Maus auf einem Heizkissen, um ihre Körpertemperatur warm zu halten.
4. Schmieren Sie beide Augen mit Augensalbe ein. Injizieren Sie 100 μl 0,25 % Bupivacain (um der Maus eine lokale Analgesie zu geben, die 8-12 Stunden anhält) und 100 μl 4 mg/ml Dexamethason (um die Entzündung zu reduzieren, die aus dem chirurgischen Eingriff resultieren kann) subkutan an der Inzisionsstelle. Lassen Sie die Maus mindestens 5 Minuten lang sitzen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
5. Reinigen Sie den rasierten Kopf mit drei abwechselnden Tupfern Betadin und 70% Alkohol. Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge oder einer Schere einen Schnitt in der Mittellinie, der sich von der Rückseite des Schädelbereichs zwischen den Ohren bis zum vorderen Bereich zwischen den Augen erstreckt. Die restliche Haut wird geschnitten, um den Schädel freizulegen.
6. Reinigen Sie das Bindegewebe zwischen der Kopfhaut und dem darunter liegenden Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und lokalisieren Sie den Gehirnbereich, der mit stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden soll.
   HINWEIS: Es gibt oft Blutungen (Schritt 1.5) aus dem Schnitt auf der Schädeloberfläche. Diese Blutung verschwindet in der Regel innerhalb von 3-5 Minuten von selbst. Die Reinigung mit dem Peroxid hilft. Es wird auch darauf hingewiesen, dass eine vorherige Behandlung mit Bupivacain (Schritt 1.4) das Ausmaß der Blutung während dieser Zeit begrenzt.

2. Implantation von Maus-Schädelfenstern

1. Bohren Sie mit einem Zahnbohrer (0,7 mm Spitzendurchmesser) eine kreisförmige Öffnung ~4 mm in den Schädel und entfernen Sie diesen Teil des Schädels vorsichtig mit einer spitzen Pinzette. Für die Darstellung des somatosensorischen Kortex von 6-8 Wochen alten Mäusen lokalisieren Sie das Zentrum der Kraniotomie bei -2,5 posterior und ± 2,0 lateral zum Bregma. Befeuchten Sie den Schädel während des Bohrens regelmäßig mit steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen, um das Gehirn zu kühlen, Knochenreste zu entfernen und den Schädelknochen für eine eventuelle Entfernung weich zu machen.
   HINWEIS: Die Koordinaten für die Kraniotomie variieren je nach interessierender Region und Alter der Mäuse.
2. Nachdem du den Schädel entfernt hast, lege vorsichtig ein kleines, mit Kochsalzlösung angefeuchtetes Deckglas (Größe #0 bei 0,1 ± 0,02 mm Dicke) in die Kraniotomie. Trocknen Sie überschüssige Kochsalzlösung mit einem sterilen Tuch ab.
3. Tragen Sie mit einem spitzen Applikator (wie einer Pipettenspitze oder dem spitzen Ende eines zerbrochenen hölzernen Wattestäbchens) den Cyanacrylatkleber um das Fenster herum auf und lassen Sie ihn am Gehirn und Schädel haften. Tragen Sie den Grundkleber auf den Rest des Schädels auf und härten Sie ihn mit einer Polymerisationslampe 20-40 s lang aus. Bereiten Sie mit dem Endkleber eine Vertiefung um das Fenster vor und härten Sie sie mit einer Polymerisationslampe von 20-40 s aus.
4. Klebe eine kleine Kopfplatte auf den Schädel auf der kontralateralen Hemisphäre der Kraniotomie, zuerst mit dem Primerkleber als Primer und dann mit dem finalen Kleber. Beide werden mit dem Polymerisationslicht jeweils 20-40 s lang ausgehärtet.
   HINWEIS: Nähte sind unnötig, wenn der Schädel während dieser Prozedur mit Klebstoff bedeckt ist.

3. Postoperative Pflege

1. Lassen Sie die Maus ohne Betäubung aufwachen (die Genesung auf einem Heizkissen verkürzt die Erholungszeit) und bringen Sie sie in ihren Heimatkäfig zurück, sobald sie vollständig wach ist. Injizieren Sie eine subkutane Dosis Buprenorphin SR (0,5 mg/kg) als postoperative Analgesie, die für 72 Stunden ausreicht.
2. Um eine gesunde Genesung von der Operation zu erleichtern, geben Sie der Maus besonders weiches Futter, wie normales festes Futter, das in Wasser eingeweicht wird, um es weicher zu machen, oder Futter in Form eines Gels.
   HINWEIS: Eine einmalige Zufuhr von weicher Nahrung unmittelbar nach der Operation ist ausreichend.
3. Überwachen Sie die Maus täglich auf Gesundheit und ordnungsgemäße Genesung in den ersten 72 Stunden des chirurgischen Eingriffs. Danach wird die Bildgebung der Fensterimplantation bereits nach 2 Wochen durchgeführt.
   HINWEIS: Wenn es gut gemacht wird, erholen sich Mäuse gut und zeigen normales ambulantes Verhalten, ausreichende Käfigerkundung, gute Flüssigkeitszufuhr, stabile Gewichtszunahme und umfangreiche Interaktionen mit anderen Mäusen im Käfig und anderen Gegenständen im Käfig. Mäuse, die nach der Operation Lethargie, Dehydrierung und einen Gewichtsverlust von mehr als 10 % zeigen, werden eingeschläfert und aus der Studie entfernt.

4. Zwei-Photonen-Gehirn-Mapping für die erste Bildgebung

1. Betäuben Sie die Maus (Isofluran, 5 % Induktion und 1,5 % Erhaltung). Stabilisieren Sie den Kopf mit Schrauben, um die Kopfplatte auf dem Zwei-Photonen-Mikroskoptisch zu befestigen, während Sie auf einer Heizplatte bei 35 °C gehalten werden. Injizieren Sie intraperitoneal 100 μl Blutgefäßfarbstoff wie Rhodamin B (2 mg/ml).
   HINWEIS: Die Bildgebung kann auch bei wachen Mäusen ohne Betäubung durchgeführt werden. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Anästhesie die Dynamik der Mikroglia-Überwachung beeinflusst. Die Kopffixierung für die Zwei-Photonen-Bildgebung bei wachen Mäusen erhöht den Stress auch während der chronischen Bildgebung für mindestens 25 Tage.
2. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensters vorsichtig mit einem Wattestäbchen, das mit 70% Ethanol getupft ist. Geben Sie ein paar Tropfen Wasser oder Kochsalzlösung auf das Schädelfenster und senken Sie die Objektivlinse in die Lösung, da es sich bei dem Objektiv um eine Tauchlinse handelt.
3. Zeichnen Sie von Hand eine grobe Karte, um die wichtigsten Orientierungspunkte der Blutgefäße in einem Labornotizbuch zu markieren, während Sie durch das Okular durch Epifluoreszenz schauen. Verwenden Sie diese Zeichnung, um die spezifischen Bereiche während der Zwei-Photonen-Bildgebung zu identifizieren. Alternativ können Sie Bilder von den Blutgefäßen entweder mit einer am Mikroskop angebrachten Kamera oder mit einer Handkamera oder einem Telefon aufnehmen.
   HINWEIS: Diese handgezeichneten Bilder und Bilder sollen es erleichtern, die gleichen breiten Bereiche unter dem Mikroskop vor der Zwei-Photonen-Bildgebung erneut zu betrachten. Dabei handelt es sich nicht um präzises Image-Mapping.
4. Unter Zwei-Photonen-Bildgebung, sammeln Sie nach Bedarf Bilder von fluoreszierenden Zellen und Gefäßen. Machen Sie sich sorgfältig Notizen mit geeigneten Koordinaten, um sicherzustellen, dass die genauen Regionen für die nachfolgende Bildgebung erneut besucht werden können. Erfassen Sie in dieser ersten Bildgebungssitzung mehrere Sichtfelder, z. B. alle 1-2 μm Z-Stapel-Bilder durch ein Gewebevolumen.
   HINWEIS: Beim Sammeln von Bildern mit zwei Photonen werden die Orientierungspunkte der Blutgefäße für die grobe Kartierung verwendet. Wenn eine Feinkartierung erforderlich ist, werden YFP-markierte Dendriten von Thy1-YFP-Mäusen verwendet.
   1. Verwenden Sie diese empfohlenen Parameter für die Bildgebung: eine Wellenlänge von 880-900 nm ist optimal; für GFP und/oder dsRed / Rhodamin Anregung wird ein 565 nm dichroitischer Spiegel mit 525/50 nm (grüner Kanal) und 620/60 nm (roter Kanal) Emissionsfilter verwendet; für die GFP und YFP Trennung wird ein 509 nm dichroitischer Spiegel mit 500/15 und 537/26 nm Emissionsfiltern verwendet; die Leistung am Gehirn wird bei 25 mW oder darunter gehalten; die Bildauflösung beträgt 1024 x 1024 Pixel, das Sichtfeld, das mit einem 25X 0,9 NA Objektiv bei einem 1,5-fachen Zoomfaktor aufgenommen wurde, beträgt 295,24 x 295,24 μm.
5. Nehmen Sie am Ende der Bildgebung die Maus vom Tisch, lassen Sie sie aus der Narkose erwachen und kehren Sie bis zu einer zukünftigen Bildgebungssitzung in ihren Heimatkäfig zurück.

5. Zwei-Photonen-Bildgebung und Re-Imaging

1. Für zukünftige nachfolgende Bildgebungssitzungen, die zwischen einigen Stunden und Monaten nach der ersten Bildgebungssitzung stattfinden können, betäuben Sie die Maus (Isofluran, 5% Induktion und 1,5% Wartung), montieren Sie sie auf das Zwei-Photonen-Mikroskop, halten Sie sie auf einer Heizplatte und injizieren Sie erneut 100 μl einen Blutgefäßfarbstoff wie Rhodamin B (2 mg/ml).
2. Öffnen Sie die zuvor erhaltenen Bilder in ImageJ und identifizieren Sie anhand dieser Bilder sowie der Notizen aus der vorherigen Sitzung die zuvor abgebildeten Bereiche und bilden Sie sie sorgfältig neu ab.
3. Wiederholen Sie dies so lange, wie das Bildfenster klar ist oder so wichtig für den Umfang der Studie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Cyanacrylat-Kleber (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Bohrer	Fine Science Tools<
Eye Salbe	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamin B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)	<
Top Dent (Ivoclar Vivadent)<
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

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